Экология СПРАВОЧНИК

В 1930 г. вышла книга Холдейна о ферментах [1], прочесть которую стоит и сегодня. Более всего в этой книге меня поразило несоответствие между обширностью для того времени знаний о свойствах и действии ферментов и их ограниченностью в отношении химической природы ферментов: вопрос о том, являются ли ферменты белками, все еще широко дискутировался. Такая односторонность была обусловлена отсутствием методов, позволяющих проводить прямое исследование ферментов. Вся информация носила косвенный характер — ее источником служили опыты по действию ферментов на соответствующие субстраты. Тем не менее уже спустя немногим более 30 лет после получения Бухнером в 1897 г. бесклеточного экстракта ферментов были заложены основы современной ферментативной стационарной кинетики.

Далее

Значения рКй взяты из справочника Data for biochemical research, Dawson R. М. C„ Elliott D. c., Eiilotf W. H., Jones К. М., Oxford University Press (1969).Способность отдельных полипептидных цепей к самопроизвольной укладке позволяет сделать важный вывод: трехмерная структура белка определяется генетически детермируемой аминокислотной последовательностью.

Далее

Значение рентгеноструктурного анализа в энзимологии, пожалуй, невозможно переоценить. Этот метод не только стал экспериментальной основой, позволившей получить все известные к настоящему времени данные о структуре белков, но и оказался наиболее ценным методом исследования механизмов ферментативного катализа. В этом разделе мы вкратце рассмотрим, какую информацию позволяют получить рентгеноструктурные исследования белков.

Далее

Полипептидные цепи фибриллярных белков организованы в так называемую вторичную структуру, стабилизируемую водородными связями. В этих упорядоченных областях атом кислорода каждой пептидной группы образует водородную связь с ИН-группой соответствующей пептидной связи. При этом формируются структуры двух основных типов: а-спираль (как показал рентгеноструктурный анализ фибрилл а-кератина) или р-структу-ра (в случае Р-кератина). Поли-пептидная цепь глобулярного белка также самопроизвольно укладывается с образованием локальных упорядоченных областей.

Далее

Предполагается, что большинство белков можно рассматривать в первом приближении как структуру типа сэндвича, каждый слой которой состоит либо из а-спиралей, либо из р-струк-тур. Недавно Левитт и Чотиа [10] предложили простой и наглядный способ изображения таких структур (рис. 1.9). Упаковка спиральных и складчатых участков происходит за счет стэкинг-взаимодействия боковых цепей аминокислот. Внутренняя область белка имеет плотную упаковку: боковые цепи одного участка встраиваются между боковыми цепями другого, образуя гидрофобное ядро, плотность которого близка к плотности жидкого углеводорода или воска [11]. В этой области мало водородных связей: так, в карбоксипептидазе А их число равно только 17; они соединяют друг с другом 8 спиралей и одну складчатую структуру, т. е. на каждый спиральный участок приходится менее двух водородных связей. Расположенные во внутренней области белка доноры и акцепторы, способные образовывать водородные связи, всегда спарены. Участки, соединяющие друг с другом спирали и слои, обычно доступны для растворителя и непротяженны. Таким образом, глобулярные белки имеют гидрофобное ядро, на поверхности которого расположены заряженные группы.

Далее

Трехмерную структуру белка, состоящего из единственной полипептидной цепи или из ковалентно связанных цепей, называют его третичной структурой. Многие белки состоят из субъединиц, не связанных друг с другом ковалентно. Пространственная организация такого комплекса известна под названием чет-вертичной структуры. Трехмерная структура каждой субъединицы по-прежнему называется ее третичной структурой. Изменение четвертичной структуры означает, что субъединицы сместились друг относительно друга.

Далее

Этот вопрос является как нельзя более уместным, поскольку все данные о структурных особенностях ферментов и механизме их действия были получены при исследовании кристаллических белков. Когда-то ответить на поставленный выше вопрос было довольно трудно, но имеющиеся в настоящее время данные, как правило, дают положительный ответ. Сомнения остаются лишь относительно активного центра карбоксипептидазы (гл. 12), да и то только по поводу подвижной боковой цепи остатка тирозина.

Далее

Волнение, вызванное выявлением того факта, что белки, связывающие кислород,— гемоглобин и миоглобин — имеют одинаковую третичную структуру и выполняют одинаковые функции, вновь овладело учеными, когда было установлено, что аналогичная ситуация имеет место в случае сериновых протеаз млекопитающих. Эти ферменты названы так потому, что они имеют уникальный по своей активности сериновый остаток, который необратимо реагирует с фосфорорганическими соединениями, например с диизопропилфторфосфатом. Основные панкреатические ферменты — трипсин, химотрипсин и эластаза — кинетически весьма близки и гидролизуют пептиды и синтетические сложные эфиры. Их активность имеет оптимум при РН 7,8 и определяется состоянием ионизации групп с рК = = 6,8. Во всех трех случаях в процессе реакции образуется «ацилфермент», в котором карбоксильный фрагмент субстрата образует сложноэфирную связь с гидроксильной группой активного серина.

Далее

Карбоксипептидаза А гидролизует белки с С-конца полипеп-тидной цепи. Она специфична в отношении гидрофобных боковых цепей фенилаланина, тирозина и триптофана. Карбоксипептидаза В специфична в отношении положительно заряженных боковых цепей лизина и аргинина. Между этими ферментами существует такая же связь, как между химотрипсином и трипсином. Их аминокислотные последовательности идентичны на 49%. Что касается различий в третичной структуре, то они имеются лишь в участках молекул, расположенных на поверхности. Основное отличие состоит в том, что остаток 11е-255, находящийся в кармане карбоксипептидазы А, в карбоксипептидазе В заменен на Asp-255, необходимый для связывания положительно заряженных боковых цепей основных субстратов.

Далее

Вполне разумно предположить, что ЫАО+-зависимые дегидрогеназы — класс ферментов, связанных с одним и тем же кофактором и обладающих одной и той же функцией — составляют группу структурно родственных ферментов. По-видимому, так оно и есть, однако структурное родство проявляется не столь четко, как в случае сериновых протеаз. При наложении молекул лактатдегидрогеназы акулы и растворимой малатдегидрогеназы свиньи (первых двух ферментов класса ЫА0+-зависимых дегидрогеназ, которые удалось получить в кристаллическом виде) наблюдается почти полное их совмещение; исключение составляют первые 20 остатков лактатдегидрогеназы. Вполне естественно было предположить, что эти ферменты произошли от общей дегидрогеназы-предшественника. Установление структуры алкогольдегидрогеназы из печени лошади и глицеральде-гид-3-фосфат—дегидрогеназы омара, которая оказалась существенно иной, усложнило картину, хотя и обнаружилось, что каждый из четырех ферментов состоит из двух доменов и один из них одинаков у всех четырех белков. Это участок, на котором происходит связывание NAD+ (рис. 1.13).

Далее

Удивительная особенность ферментативного катализа состоит в том, что фермент специфическим образом связывает субстрат и все реакции протекают внутри фермент-субстратного комплекса. Таким образом, чтобы понять, как работает фермент, необходимо знать структуру не только нативного фермента, ной комплексов фермента с субстратами, а также промежуточных соединений и продуктов. Только в этом случае мы сможем понять, как происходит связывание субстрата, какие каталитические группы участвуют в этом процессе и какие структурные изменения происходят в субстрате и ферменте при образовании фермент-субстратного комплекса. Основная трудность на этом пути связана с тем, что реакции в фермент-субстратных комплексах и образование продуктов протекают за доли секунды, тогда как для снятия рентгенограммы требуется, как правило, несколько часов. В связи с этим обычно определяют структуру комплексов ферментов с продуктами реакции, ингибиторами или аналогами субстратов.

Далее

Отправным пунктом в первых опытах по определению структуры фермент-субстратного комплекса, в котором субстрат связан продуктивно, была структура стабильных комплексов между ферментом и ингибитором. Классическим примером такого рода является установление структуры лизоцима (см. конец данной главы). Указанный подход можно реализовать несколькими способами. Например, можно связать определенную часть молекулы субстрата с ферментом и установить структуру остальной части путем построения модели. Другой способ состоит в использовании не способного к ферментативному превращению аналога субстрата, в котором модифицирована реакционноспособная связь. Показательным примером применения подобного подхода может служить связывание рибонуклеазой фосфоната вместо фосфата (гл. 12, разд. В).

Далее

В заключение отметим, что связывающие участки лизоцима и сериновых протеаз почти комплементарны субстратам: неполярные участки субстрата контактируют с неполярными боковыми цепями аминокислот; участки субстрата, способные образовывать водородные связи, связываются с NH-группами полипеп-тидного остова белка или (как в случае лизоцима) с полярными боковыми цепями аминокислот. Благодаря этому подвергающаяся каталитическому превращению часть субстрата удерживается вблизи кислых, основных или нуклеофильных групп фермента.

Далее

Из структурных и кинетических исследований ферментов известно, что эти молекулы имеют определенные участки, связывающие субстраты, что иногда они образуют промежуточные соединения с ковалентными связями и содержат кислые, основ ные и нуклеофильные группы. В этой главе мы рассмотрим причины, по которым указанные особенности ферментов необходимы для катализа, и механизм их использования. Роль энергии фермент-субстратного связывания будет рассмотрена в гл. 10.

Далее

В основе многих концепций катализа лежит теория переходного состояния. Поскольку даже поверхностное знакомство с этой теорией значительно упрощает понимание одних представлений и совершенно необходимо для понимания ряда других, мы рассмотрим ее основные положения и область применения. Затем мы обсудим основные принципы химического катализа и факторы, определяющие каталитическую эффективность ферментов, далее ознакомимся с наиболее развитыми областями кинетики и основами гомогенного катализа и прежде всего обсудим, какие факторы определяют реакционную способность молекул (что такое хорошая нуклеофильность и что такое хорошая уходящая группа для данной реакции); остановимся также на зависимости реакционной способности молекул от их структуры. И наконец, для удобства попутно изложим некоторые сведения из области кинетики и стереохимии.

Далее

Ценность теории переходного состояния заключается в том, что она связывает скорость реакции с разностью энергий Гиббса для переходного и основного состояний. Это особенно важно при рассмотрении относительной реакционной способности субстратов или при сравнении скорости данной реакции в различных условиях. Иногда удается рассчитать отношение скоростей или в более общем случае качественно определить характер изменения реакционной способности. Например, щелочной гидролиз такого эфира, как фенилацетат, включает атаку нейтрального реагента в основном состоянии отрицательно заряженным гидроксил-ионом. Это означает, что переходный комплекс должен нести некоторый отрицательный заряд, перенесенный на эфир. Можно ожидать, что л-нитрофенилацетат является более реакционно-способным соединением, чем фенилацетат, поскольку нитрогруппа оттягивает на себя электрон и стабилизирует отрицательно заряженное переходное состояние. Рассмотрим спонтанное разложение трет-бутилбромида на ион трет-бутилкарбония и бромид-ион. Переходное состояние этой реакции должно иметь биполярный характер, поэтому полярный растворитель (например, вода) будет стабилизировать его, а неполярный (например, диэтиловый эфир)—дестабилизировать. В гл. 10 и 11 мы рассмотрим применение теории переходного состояния для количественного анализа ферментативных реакций—выявления зависимости реакционной способности и специфичности от структуры при дискретном изменении структуры субстрата.

Далее

Для применения теории переходного состояния, а также при анализе данных по зависимости реакционной способности реагентов от структуры весьма полезен постулат Хэммонда. Постулат утверждает, что если в ходе реакции образуется нестабильное промежуточное соединение, то переходный комплекс будет близок к нему по структуре. Связано это с тем, что нестабильному промежуточному соединению отвечает неглубокий минимум на диаграмме изменения энергии системы вдоль координаты реакции, расположенный вблизи максимума кривой. Постулат Хэммонда позволяет предсказать структуру переходного состояния и способ его стабилизации. Например, промежуточным соединением в реакции, катализируемой лизоцимом, является карбоксоний-ион (рис. 2.2). Поскольку это нестабильное высокоэнергетическое соединение, есть основания считать, что переходное состояние имеет структуру карбоксоний-иона.

Далее

Чтобы показать, насколько велика роль катализа, рассмотрим некатализируемые реакции, которые в принципе ускоряются химотрипсином и лизоцимом.Некатализируемый гидролиз ацеталя сопровождается образованием переходного состояния, близкого по своей структуре к карбоний-иону и алкоксид-иону.

Далее

Эффективность общего катализа реакции гидролиза эфира оценивается по возрастанию константы скорости реакции гидролиза при увеличении концентрации кислоты или основания. Обычно это делается при постоянном значении pH, что обеспечивает постоянство отношения кислых и основных форм катализатора. Важно, чтобы ионная сила реакционной смеси сохранялась постоянной, поскольку многие реакции чувствительны к изменению концентрации солей. Чтобы выяснить, какой формой катализатора — кислой или основной — осуществляется катализ, необходимо провести измерения, меняя состав буфера. Скорость гидролиза эфира обычно пропорциональна концентрации основного компонента буфера, т. е. имеет место общий основный катализ. Наклон прямой, представляющей собой зависимость константы скорости от концентрации основания, дает константу скорости второго порядка для общего основного катализа (рис. 2.3).

Далее

Как мы видели, кислотно-основный катализ является эффективным средством ускорения химических реакций. Можно ли из этих данных определить, какова роль данного механизма в ферментативном катализе? Непосредственное перенесение результатов предыдущего раздела на ферменты встречает принципиальные затруднения. Дело в том, что каталитические реакции в растворе — это реакции второго порядка скорость реакции возрастает с увеличением концентрации катализатора), тогда как реакции, протекающие в пределах фермент-субстрат-ного комплекса, представляют собой реакции первого порядка, причем кислоты и основания являются составной частью молекулы фермента. Возникает вопрос: какую концентрацию кислоты или основания следует использовать в расчетах? Экспериментальный подход к этой проблеме состоит в синтезе соединений с каталитической группой, являющейся частью молекулы субстрата, и в последующем сравнении скоростей реакций с участием этих соединений со скоростями соответствующих внутримолекулярных реакций.

Далее

Высокая эффективная концентрация внутримолекулярных групп — один из наиболее важных факторов, обусловливающих эффективность ферментативного катализа. Теоретически это можно понять с позиций теории переходного состояния и из анализа энтропийного члена в уравнении (2.7) для константы скорости. Эффективные концентрации можно определить путем подстановки изменения энтропии в член ехр(Д5+/ ) уравнения (2.7).

Далее

Проведенные недавно расчеты показали, что энергия стабилизации карбоний-иона в реакции, катализируемой лизоцимом, составляет 37,6 кДж (9 ккал); стабилизация осуществляется за счет взаимодействия с карбоксилат-ионом Аэр-52 (относительно неионизированной карбоксильной группы) [25]. Это эквивалентно увеличению скорости в 4-106 раз.

Далее

Одна из функций, которую выполняют металлы в металло-ферментах, состоит в том, что они выступают в роли электро-фильных катализаторов, стабилизирующих образующиеся отрицательные заряды. В карбоксипептидазе (гл. 12) карбонильный кислород амидной группы субстрата связан координационной связью с ионом цинка этого фермента, что приводит к поляризации амида, подвергающегося нуклеофильной атаке, и эффективной стабилизации тетраэдрического промежуточного соединения.

Далее

Примером того, как кратковременная химическая модификация может активировать субстрат, является образование шиффова основания при конденсации амина с карбонильным соединением.После таутомеризации, в результате которой образуется енамин, атом углерода метиленовой группы активируется как нуклеофил. Еще одним следствием образования шиффова основания является облегчение атаки нуклеофилом карбонильного углерода вследствие сильного оттягивания электронов протони-рованным атомом азота.

Далее

Тиаминпирофосфат [схема (2.51)]—еще один кофермент, который образует с субстратом ковалентную связь и стабилизирует отрицательный заряд.Положительный заряд на атоме азота облегчает ионизацию атома С-2 с помощью электростатической стабилизации. Этот ионизированный атом углерода является мощным нуклеофилом.

Далее

Гидролиз пептидов этими протеазами—пример классического нуклеофильного катализа. Относительно инертный пептид превращается в значительно более реакционноспособный эфир или тиоэфир (ацилфермент), который затем быстро гидролизуется. Использование гидроксила серина вместо осуществления прямой атаки субстрата молекулой воды дает ряд преимуществ. Спирты часто являются лучшими нуклеофилами, чем вода, как в случае общего основного катализа, так и при прямой нуклеофильной атаке; реакция с остатком серина является внутримолекулярной и, следовательно, энтропийно более выгодной; реагирующие гидроксильные группы серина фиксированы более жестко, чем в случае связанной молекулы воды.

Далее

Один из наиболее плодотворных подходов при исследовании механизмов органических реакций состоит в сопоставлении изменения реакционной способности реагентов с изменением их структуры. Эти исследования дали ценную информацию об электронной структуре переходных состояний и факторах, определяющих реакционную способность, и позволили установить, чем является конкретная группа — хорошим нуклеофилом или хорошей уходящей группой. При исследовании зависимости реакционной способности от структуры выявляют влияние изменений в структуре субстрата на его взаимодействие с ферментом, а не на изменения электронной структуры переходного состояния. Из подобных исследований обычно трудно получить информацию о требованиях, предъявляемых в ферментативной реакции к электронной структуре субстрата, поскольку в субстрат могут быть внесены лишь минимальные изменения, а индуктивные эффекты, обусловленные введением заместителей, часто замаскированы эффектами, обусловленными связыванием. Однако полученные данные оказались неоценимыми для выяснения механизмов ферментативных реакций.

Далее

Количественно оценить чувствительность реакции к изменению электронной плотности атакующего нуклеофила можно путем измерения констант скорости второго порядка для реакций, где определенный эфир атакуется рядом нуклеофилов. Аналогично тому, как это делалось для общего основного катализа, строят график зависимости логарифма константы скорости от >Ка нуклеофила. Обычно в тех случаях, когда используются лишь нуклеофилы сходной химической природы и когда диапазон значений р/Са невелик, получается линейная зависимость. Наклон прямой обозначается буквой р, как и в случае общего основного катализа.

Далее

Эффективность общего кислотно-основного катализа кислород- и азот-содержащими основаниями зависит только от их р/Са и не зависит от химической природы этих соединений (за исключением случая повышенной активности оксимов при общем кислотном катализе), а на нуклеофильную реакционную способность заметно влияет природа реагентов. Эти реакции можно разделить на два больших класса в зависимости от того, слабые или сильные электрофильные центры при этом атакуются [45].

Далее

Реакции, в которых участвует дрожжевая алькогольдегидро-геназа, анализировались с помощью более совершенных методов [53]. Чтобы оценить по отдельности влияние заместителей на электронную структуру и вклад, вносимый энергией гидрофобного взаимодействия (гл. 9, разд. А), использовали метод множественной линейной регрессии. Аналогичный анализ был проведен и в случае реакций, катализируемых ацетилхолинэстера-зой [54]. Упоминавшаяся в обоих примерах энергия связывания, за счет которой увеличивается йсбудет подробно рассмотрена в гл. 10.

Далее

Принцип детального равновесия используется в термодинамике для того, чтобы установить ограничения, налагаемые на вероятность переходов между различными квантовыми или другими состояниями. Этот принцип применим также и к химическим ферментативным реакциям, если рассматривать каждое промежуточное соединение или конформацию как «состояние». Принцип детального равновесия требует, чтобы переходы между двумя любыми состояниями в равновесии происходили с равной частотой в прямом и обратном направлениях [55]. Это означает, что процесс А->В точно уравновешен процессом В->А и, таким образом, равновесие не может поддерживаться за счет циклического процесса, при котором в одном направлении идет реакция А В, а в противоположном В С А. В другой формулировке, более удобной для кинетических исследований, этот принцип гласит, что в равновесии прямая реакция протекает по пути, в точности противоположному пути протекания обратной реакции. Другими словами, переходные состояния для прямой и обратной реакций идентичны. Это справедливо также для (нецепных) реакций в стационарном состоянии [56].

Далее

При анализе рН-зависимости скорости химических реакций возникает неопределенность, от которой нельзя избавиться и которая известна как принцип кинетической эквивалентности. Когда из уравнения скорости реакции следует, например, что скорость реакции пропорциональна концентрации кислоты НА, это означает, что весь заряд ионов, на которые диссоциирует кислота, присущ и переходному состоянию, т. е. либо это недис-социированная кислота, либо два иона, Н+ и А . Аналогичным образом, если скорость реакции пропорциональна концентрации А , то переходное состояние содержит либо А , либо НА и ОН . Формально этот принцип можно проиллюстрировать следующим образом.

Далее

Иногда информацию о глубине протекания и природе стадий образования и разрыва связей в переходном состоянии удается получить, изучая влияние изотопного замещения на скорости реакций. Эти эффекты можно разделить на два класса в зави симости от положения замещенных атомов.

Далее

Рассматриваемые изотопные эффекты являются весьма ценным инструментом исследования простых химических реакций, хотя величины этих эффектов могут сильно варьировать. Например, установлено, что для реакций типа (2.86), катализируемых по механизму общего основного катализа, отношение йн/йо равно 2, тогда как для нуклеофильной атаки эфира оно близко к 1. Изотопные эффекты в ферментативных реакциях труднее интерпретировать, поскольку в молекуле белка слишком много протонов, которые способны обмениваться на атомы дейтерия [64]. Кроме того, при замене растворителя может слегка измениться структура белка.

Далее

Представление о том, что ферменты обладают специфичностью только к одному из двух оптически активных изомеров субстрата, не менее старо, чем сама стереохимия. Пастер, гениальный химик и биохимик, сообщил в 1858 г., что он обнаружил дрожжи, сбраживающие правовращающую винную кислоту и не способные сбраживать левовращающую. Ранние исследования протеаз показали, что гидролизуются производные только Ь-, но не Э-аминокислот.

Далее

Еще одним примером такого рода служат реакции между карбонильными соединениями и соединениями с двойными уг-лерод-углеродными связями. Если реагент атакует плоский три-гональный атом углерода только с одной стороны, то образуется оптически активное соединение. Например, если на схеме (2.91) нуклеофил атакует ацетальдегид «с фронта», то образуется продукт, изображенный слева, тогда как при атаке с «тыла» образуется энантиомер, изображенный справа.

Далее

Перенос на альдегид также стереоспецифичен. Образующийся спирт - схема (2.102)] является S-энантиомером и обладает оптической активностью с удельным оптическим вращением —0,28 ± 0,03° [70].Фумараза катализирует присоединение составных частей воды по двойной связи фумарата [схема (2.103)].

Далее

Концепция стационарного состояния широко используется в динамических системах. Система находится в стационарном состоянии, если некоторые существенные для ее характеристики величины не меняются со временем или если скорость образования какого-либо существенного компонента системы равна скорости его распада. Например, в стационарном состоянии скорость увеличения численности населения данной страны равна скорости его убыли. Аналогичным образом концентрация метаболита в клетке стационарна, если скорость его образования равна скорости распада. В ферментативной кинетике эта концепция применяется к концентрациям ферментсодержащих промежуточных соединений. При смешивании фермента с большим избытком субстрата наблюдается период, известный под названием предстационарного, во время которого концентрации этих промежуточных соединений выходят на стационарный уровень. Вслед за этим скорость реакции меняется со временем сравнительно медленно, и можно считать, что концентрации промежуточных соединений являются стационарными. По традиции скорость ферментативных реакций измеряют именно на этом стационарном участке. Стационарное состояние является известной аппроксимацией, поскольку субстрат постепенно расходуется в ходе эксперимента. Однако, если скорость измеряется за достаточно короткий отрезок времени и концентрация субстрата остается практически постоянной, это приближение является достаточно хорошим.

Далее

Каталитическая реакция состоит из двух стадий. Сначала фермент и субстрат соединяются и образуют фермент-субстрат-ный комплекс ЕБ. Предполагается, что эта стадия протекает быстро и обратимо и не сопровождается какими-либо химическими изменениями; фермент и субстрат удерживаются вместе за счет сил физической природы. На второй стадии протекают химические процессы, характеризующиеся константой скорости первого порядка ксл (число оборотов).

Далее

Не следует отождествлять уравнение и механизм, предложенные Михаэлисом и Ментен. Уравнение выполняется для многих механизмов, механизм же не всегда согласуется с полученными данными.Механизм Михаэлиса — Ментен предполагает, что фермент-субстратный комплекс находится в термодинамическом равновесии со свободными ферментом и субстратом. Это справедливо только в том случае, если в уравнении (3.10) к2 «С А г.

Далее

Образование вслед за фермент-субстратным комплексом промежуточных соединений [как в схеме (3.19)] —чрезвычайно широко распространенное явление. Однако в случае физиологических субстратов эти промежуточные соединения часто не накапливаются и медленной стадией в последовательности реакций (3.19) является стадия с константой скорости ¿2. (Обусловлено это причинами принципиального характера, обсуждающимися в гл. 10, где приведены соответствующие примеры.) При этих условиях Км равна Кб (константе диссоциации) и первоначально предложенный механизм Михаэлиса — Ментен оказывается всегда выполнимым. Для многих экспериментальных систем наблюдается обратная картина. Исследователи часто используют в опытах синтетические высокореакционные субстраты; в этих условиях часто происходит накопление содержащих ковалентные связи промежуточных соединений.

Далее

Часто параметр ¿cat называют числом оборотов фермента, поскольку он определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт одним активным центром в единицу времени.

Далее

Здесь взаимодействие активной формы фермента с субстратом представляет собой реакцию второго порядка; в результате образуются продукты и неактивная форма Е , которая медленно переходит в активную. Этот случай служит примером кинетики с кажущимся насыщением; при этом kca = k2, а Км = к2/ки Если рассматривать Е как «связанную» форму фермента, то можно применять уравнение (3.24).

Далее

Как было показано ранее [уравнение (3.3)], скорость реакции при низких концентрациях субстрата определяется уравнением V = (бса Ям) [Е] о [Э], т. е. отношение к /Км представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Этот параметр не является истинной микроскопической константой, за исключением крайнего случая, когда реакция лимитируется столкновением фермента с субстратом.

Далее

График Лайнуивера — Бэрка имеет тот недостаток, что при высоких концентрациях субтрата экспериментальные точки попадают на небольшой отрезок, в результате чего точкам, соответствующим низким концентрациям, придается слишком большой вес. Достоинство же этого графика состоит в том, что он позволяет просто оценить значение о при данной концентрации субстрата [Б].

Далее

Помимо необратимой инактивации ферментов при нагревании или действии химических реагентов, может происходить обратимое ингибирование в ходе нековалентного связывания ингибиторов. Различают четыре основных типа ингибирования.

Далее

Можно видеть, что Км увеличивается в (1 + [I] /ЛГ1) раз. Это уравнение применимо ко всем механизмам, для которых справедливо уравнение Михэлиса — Ментен. Конкурентное ингибирование влияет только на параметр Км и не сказывается на Ушах, поскольку при бесконечно больших концентрациях субстрат вытесняет ингибитор из активного центра фермента.

Далее

Известны случаи, когда наряду с продуктивным связыванием происходит связывание субстрата с активным центром фермента таким образом, что образуется неактивный комплекс. Подобные случаи носят название непродуктивного связывания.

Далее

Отсюда следует важный вывод: специфичность, т. е. выбор ферментом только одного из двух конкурирующих субстратов, определяется отношением бса Лм, а не параметром Км как таковым. Поскольку ¿са Ям не зависит от непродуктивного связывания или накопления промежуточных соединений, эти факторы не влияют на специфичность (гл. 11).

Далее

Выведенное соотношение известно как уравнение Холдейна, которое этот ученый получил в 1930 г.

Далее

Пример сильного различия между константами равновесия для раствора и при связывании субстрата с поверхностью фермента приведен в гл. 7, разд. Д. Константа равновесия для реакции гидролиза, когда АТР находится в равновесии с АДР и ортофосфатом на поверхности молекулы миозина (Si), равна лишь 9, в то время как для раствора константа равновесия составляет 105—106.

Далее

При низких концентрациях Б уравнение скорости, как обычно, имеет вид и 1Е] о [Б] са /Сэ. Однако по мере увеличения [Б] V достигает максимального значения и затем начинает падать.Второй фактор — активация избытком субстрата: образующийся комплекс ЕБг более активен, чем ЕБ.

Далее

Упорядоченные механизмы часто имеют место в реакциях, катализируемых ЫАО+-зависимыми дегидрогеназами, причем первым связывается кофермент. Это можно объяснить тем, что связывание динуклеотида вызывает конформационное изменение, увеличивающее сродство фермента к другому субстрату (гл. 12).

Далее

Кинетические исследования ферментативных реакций, протекающих в стационарных условиях, обычно позволяют определить только два параметра: константу Михаэлиса Км, которая может быть равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса, и ¡г , в одних случаях представляющую собой микроскопическую константу скорости, а в других — комбинацию констант скорости для нескольких стадий. В распоряжении исследователя имеется ряд приемов, которые при случае можно использовать для выявления промежуточных соединений и даже для измерения индивидуальных констант скорости, однако это удается сделать далеко не всегда и зависит от механизма реакции. (Несколько примеров такого рода будут рассмотрены в гл. 7.) Чтобы найти константы скорости отдельных стадий и обнаружить «короткоживущие» промежуточные соединения, необходимо измерить скорость приближения системы к стационарному состоянию. Индивидуальные константы скорости могут быть измерены за промежуток времени, в течение которого устанавливается это состояние.

Далее

В 1923 г. Хартридж и Роутон при исследовании присоединения лигандов к дезоксигемоглобину применили метод непрерывной струи [1]. Принцип этого метода иллюстрирует рис. 4.1. Два шприца соединены через сместитель с реакционной трубкой.

Далее

Этот метод был разработан в 1934 г. Роутоном [2] и значительно усовершенствован шестью годами позже Чансом [3]. Лежащий в его основе принцип иллюстрирует рис. 4.2 [4].Метод остановленной струи является рутинным лабораторным методом, тогда как метод непрерывной струи используется только в особых случаях. Для проведения всего цикла измерений с помощью метода остановленной струи достаточно 100— 400 мкл раствора, при этом мертвое время составляет около 0,5 мс, а время регистрации может достигать нескольких минут (при наличии соответствующей аппаратуры). Применение метода непрерывной струи требует очень больших объемов, а регистрация должна проводиться только в течение 100 мс, поскольку работать с более длинными трубками очень сложно. Дополнительные трудности связаны с тем, что сканирование должно проводиться по всей длине трубки.

Далее

Ясно, что к системам, в которых протекают необратимые химические процессы, этот метод не применим. Наиболее ценен он для исследования простого связывания лигандов (например, связывания NAD+ с дегидрогеназой, связывания ингибиторов) или для исследования конформационных изменений в белке. Предпринимались попытки объединить метод температурного скачка с методом остановленной струи.

Далее

Иногда с помощью ЯМР можно измерить константы скорости диссоциации комплексов между ферментом и ингибитором. В сочетании с константами связывания для данной реакции это позволяет получить константы скорости ассоциации.

Далее

В простых случаях дифференциальные уравнения для меняющихся со временем переходных процессов решаются относительно просто. Однако важно понимать, почему данному случаю соответствует именно данная форма решения. В настоящем разделе мы сосредоточим наше внимание на интуитивном подходе к решению этой проблемы. Понимание сути вещей поможет нам избежать ошибок в алгебраических выкладках, а кроме того, мы сможем находить решение для некоторых сложных кинетических схем просто по виду этих схем.

Далее

Как [А], так и [В] являются простыми экспоненциальными функциями.Рассматривая более сложные примеры, мы воспользуемся методом начальных скоростей, чтобы проиллюстрировать физический смысл некоторых выражений. Этот метод часто применяется при изучении процессов, слишком медленных, чтобы использовать полное время реакции, а также в том случае, когда в системе протекают побочные реакции.

Далее

В тех случаях, когда субстрат в фермент-субстратном комплексе не претерпевает химического превращения (например, в отсутствие косубстрата в мультисубстратной реакции) или когда речь идет о связывании ингибитора, метод температурного скачка является наиболее ценным методом определения констант скорости связывания лиганда.

Далее

В последнем случае, когда ¿2 > ки концентрация В очень низка, а в первом, при к > к2, В накапливается. Эти два случая можно дифференцировать, варьируя 1В].Подобная ситуация иногда возникает в экспериментах по ренатурации белка, когда за кинетикой процесса следят по изменению его флуоресценции. При таких условиях выявить двухфазную кинетику нельзя, если только не известен квантовый выход образования промежуточного соединения, позволяющий определить его абсолютную концентрацию.

Далее

Как и для обратимых реакций [уравнение (4.10)], время релаксации представляет собой сумму времен релаксаций для двух реакций.Примеры параллельных реакций приведены в гл. 7 (атака различными нуклеофилами ацилхимотрипсина, кинетика которой исследована в стационарных и предстационарных условиях).

Далее

Если равновесие смещается незначительно, то возвращение к равновесию всегда является процессом первого порядка, даже если концентрации реагентов близки.

Далее

Второй пример — исследование механизма действия фермента в условиях протекания ферментативной реакции. Помимо определения стадии связывания и выявления конформационных изменений, в этой реакции необходимо исследовать стадии образования и разрыва связей и идентифицировать промежуточные соединения. Химические процессы обычно лучше всего исследовать методами, которые позволяют прямо измерить концентрацию химических соединений, например методом остановленной струи с регистрацией оптической плотности раствора и методом замороженной струи. Иногда лучше воспользоваться косвенными методами, например методом флуоресцентного анализа. Идеальной для исследования является такая ситуация, когда промежуточное соединение накапливается и его можно обнаружить и измерить концентрацию. Вообще для подтверждения имеющихся данных и получения новых следует привлекать возможно большее число различных методов. Примеры применения таких методов даны в гл. 7.

Далее

Отметим, что амплитуда связана с константами скорости квадратичной зависимостью. Если отношение достаточно велико, то квадратичный член близок к единице и амплитуда всплеска концентрации продукта равна концентрации фермента. В противном случае концентрация будет занижена, если только не будут измерены и подставлены в уравнение (4.77) обе константы скорости.

Далее

Верхний предел для констант скорости любых моно- или внутримолекулярных реакций равен частоте молекулярных колебаний— 1012—1013 с-1.

Далее

Рассчитанная таким образом константа скорости переноса протона от имидазолий-иона (р/Са = 6,95) на молекулу воды ([НгО] =55 М, р/Са = —1,74) равна 1,7-103 с-1.Перенос протона от карбоновых кислот на карбоновые основания обычно происходит гораздо медленнее. Обусловлено это тем, что более низкая электроотрицательность углеродного атома требует стабилизации отрицательного заряда на карбоновом основании путем делокализации электрона. Последующая перестройка структуры и влияние растворителя могут замедлить результирующую скорость переноса.

Далее

Константы скорости диссоциации этих комплексов значительно ниже константы, лимитируемой Диффузией, поскольку для осуществления реакции Необходимо преодолеть силы связывания. В некоторых случаях диссоциация фермент-субстрат-ных комплексов протекает медленнее, чем соответствующие последовательные химические стадии, и это приводит к механизму Бриггса — Холдейна.

Далее

Известно множество примеров реакций, которые сопровождаются индуцируемыми субстратом конформационными изменениями фермента, характеризующимися константами скорости 10—104 с-1, а также случаев, где отсутствие внутренней согласованности в значениях констант скорости свидетельствует о наличии лимитирующей стадии изомеризации белков [17]. Изомеризация действительно часто является относительно медленным процессом (например, в случае отщепления NADH от некоторых дегидрогеназ, сопровождающегося конформационным изменением белковой молекулы). Однако прямые указания на то, что процесс конформационного изменения является сам по себе лимитирующим, отсутствуют.

Далее

Легко видеть, что р/Са кислоты или основания — это pH, при котором кислота или основание ионизированы наполовину, т. е. концентрации В и ВН+ равны.Зависимость концентраций НА и А- от концентрации протонов можно определить, преобразовав уравнение (5.2).

Далее

Несмотря на то что ферменты содержат множество ионизирующихся групп, графики зависимости скорости реакции от pH имеют форму, соответствующую однократной или двукратной ионизации. Связано это с тем, что единственной важной ионизирующейся группой является группа активного центра, непосредственно участвующая в катализе, либо группа, расположенная вне активного центра, но ответственная за сохранение активной конформации фермента.

Далее

Здесь /Се — константа ионизации свободного фермента, Кеб — константа ионизации фермент-субстратного комплекса, а /(д и /С5 — константы диссоциации НЕБ и ЕЭ соответственно.Уравнение (5.15) можно получить приравниванием произведений констант ионизации и констант диссоциации или просто из рассмотрения схемы (5.14), поскольку процесс HES->ES->E должен сопровождаться таким же изменением энергии, как и процесс HES -> НЕ -> Е.

Далее

Зависимость кса от pH получается из уравнения (5.17) при условии, что [Э] Кв, т. е.Кажущееся значение Км при каждом конкретном значении pH можно найти преобразованием уравнения (5.17) к виду уравнения Михаэлиса — Ментен (3.1).

Далее

Для объяснения рН-зависимости параметров каталитического процесса в случае более сложных механизмов, чем механизм Михаэлиса — Ментен в его первоначальном виде, необходимо модифицировать рассмотренную выше в общих чертах простую теорию.

Далее

Проанализируем этот случай с привлечением математического аппарата.По причинам, обсуждавшимся ранее, рН-зависимость Ьс /Км и 1//См при наличии непродуктивного связывания не изменяется.Карр называется кинетическим р/Са, поскольку он определяется не ионизацией как таковой, а зависит от отношения констант скорости процессов, не связанных с переносом протона. Кинетические р/Са получаются всякий раз, когда природа лимитирующей стадии изменяется с изменением pH.

Далее

Для механизма Бриггса — Холдейна, характеризующегося тем, что природа лимитирующей стадии изменяется с изменением pH, прямое титрование каталитических групп будет давать истинную константу, отличающуюся от соответствующих величин, получаемых из рН-зависимости кс /Км [см. уравнение (5.31)].

Далее

На константы скорости стадий, в ходе которых совершаются химические превращения, влияет не только изменение рКа участвующих в катализе кислот или оснований, но и изменение поверхностного заряда, если оно достаточно велико. Это изменение аналогично изменению ионной силы в неферментативных ионных реакциях, а два указанных эффекта аналогичны вторичному и первичному ионным эффектам в физической органической химии.

Далее

В этом случае строят график в координатах ( саОн[Н+]; (ЙсаОн .В более сложных случаях, когда кинетический параметр не уменьшается до нуля при высоком или низком pH (как это часто имеет место на графиках зависимости констант ассоциации или диссоциации от pH), для графического анализа используется разность между наблюдаемым значением параметра при данном pH и одним из предельных значений при экстремальных pH.

Далее

Ферментом, кинетические свойства которого при разных pH изучены лучше, чем свойства остальных ферментов, является химотрипсин; хорошо известны его структурные особенности и механизм каталитического действия. Чрезвычайно широкая специфичность химотрипсина и, следовательно, возможность использования различных субстратов позволяет исследовать простой механизм Михаэлиса — Ментен, механизм с накоплением промежуточных соединений, обнаруживать непродуктивное связывание и анализировать механизм Бриггса — Холдена с изменением природы лимитирующей стадии при варьировании pH.

Далее

Существует несколько методов прямого титрования определенных ионизирующихся боковых цепей в белках. Одна из основных проблем заключается в идентификации данной группы.ЯМР-спектроскопия на ядрах 13С позволяет определить р/Са остатков лизина и аспартата. Ионизация остатков тирозина исследовалась с помощью ПМР.

Далее

Полярные растворители стабилизируют ионы — электростатические диполи растворителя взаимодействуют непосредственно с ионами, а увеличение диэлектрической проницаемости среды уменьшает тенденцию этих ионов к реассоциации. Ионизация нейтральной кислоты НА [уравнение (5.38)] при добавлении к водному раствору слабо полярного растворителя подавляется (табл. 5.4).

Далее

Одним из необходимых условий проведения любого кинетического исследования является наличие удобного метода измерения скорости образования продуктов или скорости расходования субстратов. Для проведения подобных измерений используются самые разные методы, начиная с таких классических методов, как манометрический, вискозиметрический и поляриметрический, и кончая самыми современными — ЯМР и ЭПР. Однако наиболее широко применяются спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, автоматическое титрование, а также методы с использованием субстратов, меченных радиоактивными изотопами. В этой главе мы не будем рассматривать всех имеющихся методов, а остановимся только на самых распространенных, да и то ограничимся лишь областью их применения и практической стороной вопроса.

Далее

Чаще всего к ошибкам приводит невыполнение закона Ламберта—Бэра. Такая ситуация возникает по ряду причин.Некоторые соединения способны поглощать свет, а затем испускать его (но уже с большей длиной волны). Это явление называется флуоресценцией. Эффективность процесса характеризуется квантовым выходом <7, который равен отношению числа испускаемых квантов к числу поглощаемых (<7 всегда меньше единицы). К природным флуорофорам относится КАОН, поглощающий свет с % = 340 нм, а испускающий — с К = 460 нм, Основной флуорофор в белках — триптофан — поглощает в области 275—295 нм, а испускает свет с К = 330—340 нм. Слабо флуоресцирует в этой же области и тирозин. В основе многих синтетических субстратов эстераз, фосфатаз, сульфатаз и гли-козидаз лежит 4-метилумбеллиферон — сильно флуоресцирующее производное фенола.

Далее

Гидролитическую реакцию, в ходе которой происходит высвобождение кислоты, удобно исследовать с помощью титрования основанием. Лучше всего использовать для этого автоматическое титрование с применением рН-стата, когда pH раствора, регистрируемый стеклянным электродом, поддерживается постоянным благодаря добавлению основания с помощью шприца, управляемого электронным устройством. Объем, в котором протекает реакция, составляет всего 1 мл, а минимальное количество основания, которое можно зарегистрировать, равно 50 нмоль (5—10 мкл раствора основания с концентрацией 5-10-3—МО-2 М). Обычно источником ошибок здесь является изменение pH раствора под действием растворенного СОг.

Далее

Наиболее чувствительные методы анализа основаны на использовании радиоактивных субстратов. Объем реакционной смеси составляет в этом случае всего 20—100 мкл.Чувствительность методов с использованием радиоактивных изотопов зависит от удельной активности препарата (табл. 6.2). Иногда удается обнаружить соединение, когда его количество не превышает 10-17 моль, что на 6—7 порядков меньше, чем минимальное количество, которое можно зарегистрировать спектрофотометрически.

Далее

Константа /г определяется из графика, построенного в координатах ¿; 1п([ВЬ+д< — [В] ) , где —постоянный отрезок времени, составляющий по крайней мере два-три периода полу превращения.

Далее

Исчезновение В и накопление С представляет собой реакцию первого порядка с константой скорости псевдопервого порядка k2 [А] о. Построение графиков для серии таких реакций, имеющих разные значения [А]0, позволяет определить й2.

Далее

Как указывалось в гл. 3, Км для ферментативных реакций не всегда равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса; она может быть меньше или больше этой величины в зависимости от того, происходит накопление промежуточных соединений или выполняется механизм Бриггса — Холдейна. Чтобы на основании результатов стационарной кинетики определить константы диссоциации фермент-субстратных комплексов, необходимо либо вводить какие-то допущения о механизме реакции, либо постараться получить дополнительные данные. Более ценную информацию дает предстационарная кинетика, поскольку в этом случае стадии химического превращения субстрата и стадии связывания часто можно разграничить.

Далее

При проведении равновесной гель-фильтрации колонку уравновешивают раствором лиганда и наносят образец фермента, уравновешенный буферным раствором. Проходя через колонку, белок связывает лиганд и перемещает его с такой же скоростью, с какой движется сам. В результате положение пика, соответствующего выходу лиганда из колонки, совпадает с положением пика, отвечающего белку, тогда как впадина на кривой находится в области, обычно занимаемой небольшими молекулами. Площадь под пиком равна площади впадины и соответствует количеству связанного лиганда.

Далее

Многие белки, связанные с каким-либо медленно отщепляющимся лигандом, адсорбируются на фильтрах из нитроцеллюлозы, тогда как свободный лиганд такими фильтрами не удерживается. В некоторых случаях это дает исследователю очень экономичный метод анализа связывания. С его помощью получено много ценных данных о присоединении нуклеиновых кислот к белкам. Отметим возможные источники ошибок при использовании фильтрования: часто связывание осуществляется менее чем на 100%; фильтры могут отличаться от партии к партии и насыщаться при довольно низких концентрациях белка.

Далее

За исключением ЯМР, с помощью которого удается измерить концентрации свободного и связанного лиганда, спектроскопические методы обычно не позволяют прямо определить число связанных молекул лиганда. При связывании лиганда в спектре происходят изменения, позволяющие найти лишь долю связанного белка, и, не имея дополнительной информации, нельзя установить число присоединившихся молекул лиганда. Типичным примером такого рода является изменение в спектре флуоресценции белка или в спектре флуоресценции или поглощения лиганда, вызываемое присоединением лиганда к ферменту. Обычно в таких опытах добавляют возрастающие количества лиганда к относительно разбавленному раствору белка и строят график зависимости изменения какого-либо параметра спектра от количества добавленного лиганда. Если связываемый лиганд не является хромофором, то исследуют конкурентное ингибирование процесса присоединения лигандов-хромофоров.

Далее

Если константа диссоциации комплекса достаточно мала, можно определить число эквивалентов лиганда, которое вызывает максимальное изменение в спектре; это максимальное изменение имеет место в том случае, когда заняты все центры связывания. Например, к раствору белка, концентрация которого по крайней мере в 10 раз больше константы диссоциации, добавляются возрастающие количества субстрата. Для установления стехиометрии строят график, представленный на рис. 6.8.

Далее

Если в молекуле белка имеется два типа центров, один — сильно связывающий, а другой — слабо, то график Скэтчарда будет состоять из двух частей, относящихся к связыванию с разными центрами. Определить значения Кв из таких графиков можно только в том случае, если эти константы различаются по крайней мере в 10 раз.

Далее

Механизм ферментативной реакции можно считать полно стью установленным, если охарактеризованы все промежуточные соединения, комплексы и конформационные состояния фермента и определены константы скорости их взаимопревращений. Таким образом, задача исследователя состоит в установлении числа и последовательности промежуточных соединений и процессов, выяснении их природы (т. е. в установлении, образуются ли промежуточные соединения с ковалентными связями или имеют место конформационные изменения), в измерении констант скорости и (исходя из анализа их рН-зависимости) в определении степени участия в катализе кислых и основных групп. Исследователь должен установить химическую природу промежуточных соединений, выяснить, в ходе каких превращений они образуются и распадаются, и определить тип катализа. Все эти результаты вместе с данными рентгеноструктурного анализа и теоретическими расчетами позволят полностью описать механизм данной реакции.

Далее

Предстационарная кинетика обладает рядом преимуществ с практической точки зрения. Она имеет дело с очень простыми по сути процессами; например, с ее помощью определяют стехиометрию процесса, в ходе которого происходит «всплеск» концентрации продукта, находят константы скорости переноса связанных с ферментом промежуточных соединений на второй субстрат или исследуют индуцируемые лигандами конформационные изменения в белках. Кроме того, характеристики процессов первого порядка (которые обычно изучают) не зависят от концентрации фермента в отличие от констант скорости, измеряемых в стационарной кинетике. Для исследования быстрых реакций требуются очень высокие концентрации ферментов, но их значения близки к концентрациям in vivo. Более того, аналогичные концентрации обычно используются при прямом определении физического состояния белка, что позволяет получать, например, данные об агрегации в условиях, при которых протекает реакция.

Далее

Чтобы выяснить, выполняются ли эти условия, необходимо на какой-то стадии исследований прибегнуть к предстационарной кинетике с тем, чтобы измерить константы скорости образования и исчезновения промежуточного соединения. Однако просто провести такие измерения недостаточно — нужно показать, что полученные константы согласуются с активностью фермента в стационарных условиях. Следовательно, весьма полезно и даже необходимо использовать сочетание этих двух подходов.

Далее

Позже аналогичные эксперименты были проведены и с многими другими ферментами. Однако наличие всплеска может быть обусловлено не накоплением промежуточных соединений, а причинами иной природы, что всегда следует иметь в виду. Ниже рассмотрено несколько примеров такого рода.

Далее

В предыдущем разделе было показано, что кинетические исследования с помощью метода оставленной струи дают возможность обнаружить накапливающиеся промежуточные соединения. Стационарная кинетика не позволяет прямо выявить эти соединения, она дает лишь косвенные данные. Окончательный ответ на вопрос зависит от результатов прямых измерений с привлечением данных предстационарной кинетики. Однако стационарная кинетика позволяет выявить ненакапливающиеся промежуточные соединения и, основываясь на данных тех эспериментов, когда накопление происходит, доказать их существование и выяснить природу.

Далее

Ни постоянство величины Ушах, ни постоянство соотношения между образующимися продуктами еще не доказывают присутствия промежуточного соединения. Например, оказалось, что в случае щелочной фосфатазы постоянство значения Fmax является артефактом, а кроме того, нельзя сказать a priori, что атака комплекса Михаэлиса акцепторами также не даст постоянного соотношения между образующимися продуктами. Для того чтобы из указанных экспериментов можно было сделать четкий вывод о наличии промежуточного соединения, их необходимо связать с измерением скоростей. При измерении скоростей в рамках стационарной кинетики наиболее благоприятной является такая ситуация, когда промежуточное соединение накапливается. Если выполняются уравнения (7.4) — (7.6), можно сделать четкий вывод о существовании промежуточного соединения. Чрезвычайно полезно сочетание опытов по установлению распределения продуктов с исследованиями предстационарной кинетики (как это было сделано в случае химотрипсина и амидов).

Далее

Алкоголиз р-О-галактозидов р-галактозидазой происходит с сохранением конфигурации у атома С-1 137, 38].Тем самым из этого процесса исключаются простые реакции бимолекулярного замещения (Б ), которые часто встречаются в органической химии, поскольку известно, что они всегда идут с обращением конфигурации [39].

Далее

Ацилирование тРНК осуществляется в ходе атаки карбонильной группы карбоксилом рибозы концевого аденозина тРНК схемы (7.13) и (7.14)].Е + АА + АТР + тРНК - Е.АА-тРНК - Е + тРНК.

Далее

Активные центры миозина, присоединяющиеся к актину, расположены в глобулярных участках молекулы миозина, которые получили название Si-субъединиц. Они могут быть отделены от остальной части молекулы путем протеолиза. Полученные таким образом фрагменты более удобны для проведения кинетических исследований, чем целая молекула миозина [55]. Механизм гидролиза АТР с участием фрагмента Si в том виде, в каком его сейчас представляют, довольно сложен — это последовательность реакций, состоящая из семи стадий [схема (7.18)]. Несмотря на всю свою сложность, эта схема вполне логична [56—68].

Далее

Первые опыты по определению скоростей высвобождения ADP и Р были весьма остроумными: скорость появления в растворе свободных ADP и Р определяли с помощью сопряженных ферментных систем и метода остановленной струи с регистрацией оптической плотности [64].

Далее

При полимеризации актина (мол. вес 42 000) образуются крупные агрегаты. Каждый мономер может связать один моль фрагмента Б! (мол. вес 115 000), и образующийся в результате актомиозиновый комплекс (акто-Б!) имеет приблизительно в три раза большую массу. Этот процесс сопровождается увеличением мутности раствора, поскольку светорассеяние связано с массой полимера. Стимулируемое АТР высвобождение Б! из комплекса можно исследовать, наблюдая за уменьшением мутности раствора. Для этого прменяют метод остановленной струи с регистрацией оптической плотности. Более чувствительным, однако, является метод регистрации флуоресценции, поскольку в этом случае измерения проводятся под прямым углом к падающему световому пучку (гл. 6) [69].

Далее

Поскольку связывание «субстрата» с ферментом является специфичным, скорость химической реакции, протекающей в пределах фермент-«субстратного» комплекса, чаще всего достаточно высока благодаря энтропийному преимуществу ее над простой бимолекулярной реакцией в растворе. Следовательно, соединения, которые обычно обладают низкой реакционной способностью, могут стать очень реакционноспособными аффинными метками.

Далее

Молекулы многих белков состоят из субъединиц и имеют несколько центров связывания лигандов. В ряде случаев кривые связывания лигандов не следуют уравнению Михаэлиса — Мен-тен (глава 6, разд. Г), а имеют сигмоидный характер. Кривая такого рода представлена на рис. 8.1; она отражает зависимость степени насыщения гемоглобина кислородом от давления кислорода. Здесь же для сравнения приведена гипербола, описываемая уравнением типа уравнения Михаэлиса — Ментен, которая отражает связывание кислорода миоглобином. Сигмоидные кривые характерны для случая кооперативного связывания лигандов белками, имеющими несколько центров связывания в белковом олигомере. Так, например, молекула гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей, каждая из которых сходна с единственной полипептидной цепью миоглобина. Кривую связывания кислорода гемоглобином можно описать уравнением, содержащим четыре константы последовательного связывания (уравнение Эдера [1]). Удивительная особенность процесса кооперативного связывания состоит в том, что сродство гемоглобина к четвертой присоединяемой молекуле кислорода в несколько сот (до тысячи) раз превышает сродство к первой молекуле. Это увеличение сродства нельзя объяснить, исходя из наличия четырех невзаимодействующих центров, обладающих просто разным сродством к кислороду. В этом случае центры с высоким сродством к кислороду заполнялись бы первыми и молекула с частично заполненными центрами связывания обладала бы м«ньшим сродством, чем дезоксигемоглобин. Увеличение сродства по мере насыщения гемоглобина кислородом является результатом взаимодействия связывающих центров, приводящим к тому, что связывание молекулы кислорода с одним центром вызывает увеличение сродства другого.

Далее

Первые попытки объяснить механизм кооперативности были предприняты при исследовании свойств гемоглобина. Чтобы лучше понять смысл этих работ, рассмотрим структуру дезокси’ и оксигемоглобина. Молекула гемоглобина состоит из двух пар цепей, аир, расположенных в пространстве таким образом, что образуется симметричный тетраэдр. Гемы, являющиеся центрами связывания кислорода, располагаются достаточно далеко друг от друга и непосредственно не взаимодействуют. При ок-сигенации дезоксигемоглобина тетраэдрическая симметрия сохраняется, а в четвертичной и третичной структуре наблюдаются изменения (рис. 8.2) [3]. Из опытов по измерению констант связывания известно, что дезоксигемоглобин характеризуется низким сродством к кислороду, тогда как оксигемоглобин — высоким.

Далее

Отрицательную кооперативное нельзя объяснить, исходя из модели Моно и др., согласно которой присоединение первой молекулы лиганда только стабилизирует состояние с высоким сродством и не способно увеличить концентрацию Т-формы. Теория Кошланда и др. объясняет отрицательную кооператив-ность тем, что присоединение лиганда к одному центру вызывает конформационное изменение, которое передается на вакантную субъединицу (допущение в). Таким образом, отрицательная ко-оперативность является отличительным признаком механизма Кошланда и др.

Далее

Рассмотрим случай полностью кооперативного связывания; молекула фермента имеет п связывающих центров и лиганд присоединяется одновременно ко всем центрам.

Далее

Доля связанного с лигандом белка У рассчитывается из уравнения материального балланса. Следует помнить о необходимости введения «статистических множителей» в константы связывания. Например, константа диссоциации 1 для первой присоединяющейся к гемоглобину молекулы 02 равна/Ст/4, поскольку число центров, с которыми этот лиганд может связаться, равно четырем, а отщепление осуществляется только от одного центра. Аналогичным образом константа диссоциации для второй присоединяющейся молекулы будет равна 2/Ст/З, поскольку имеется три центра, к которым она может присоединиться, но после ее присоединения образуются два центра, от которых молекула кислорода может отщепиться.

Далее

Все это объясняет причину низкого сродства дезоксигемог-лобина к кислороду по сравнению с миоглобином или искусственно полученными отдельными цепями гемоглобина [13]. При связывании кислорода в четвертичной структуре гемоглобина происходит нарушение взаимодействий, ответственных за пониженное сродство к кислороду. Солевые мостики разрываются, и гидрофобные поверхности обнажаются. Становится понятным и механизм действия аллостерических эффекторов: органические фосфаты прочно связываются с определенным центром в Т-состоянии и затрудняют его переход в R-состояние.

Далее

Важной особенностью ферментативного катализа является то, что фермент связывает субстрат и реакция протекает в пределах фермент-субстратного комплекса. Чтобы глубже понять причины, обусловливающие прочность и специфичность этого связывания, мы рассмотрим взаимодействие между несвязанными атомами, применив эмпирический и феноменологический подход. В частности, мы уделим большое внимание значению энергии взаимодействия. Нековалентные взаимодействия важны не только потому, что они ответственны за связывание. Как мы увидим ниже (гл. 10), вместо того чтобы давать непосредственный вклад в энергию связывания, эти взаимодействия понижают энергию активации стадии химического превращения субстрата, а кроме того играют важную роль в поддержании структуры белка.

Далее

К очевидным нековалентным взаимодействиям между атомами относится электростатическое взаимодействие между заряженными группами. Но притягиваются друг к другу даже неполярные молекулы. На наличие такого взаимодействия как на одну из причин отклонения газов от идеальности указывал столетие назад Ван-дер-Ваальс. Некоторые из взаимодействий между нейтральными молекулами газа хорошо изучены, и сейчас известно несколько «соединений Ван-дер-Ваальса». Например, энергия связи между атомами в димерах благородных газов N62, Аг2 и Хе2 равна 0,2; 0,92 и 2,2 кДж-моль-1 (0,05; 0,22 и 0,53 ккал-моль-1) соответственно [1].

Далее

В табл. 9.1 приведены некоторые полуэмпирические значения параметров А и В, вычисленные из физико-химических данных; эти значения используются при расчете энергий взаимодействия.Атом углерода карбонильной или карбоксильной группы.

Далее

Согласно многочисленным оценкам, энергия водородных связей лежит вдиапазоне 12—38 кДж-моль-1 (3—9 ккал-моль-1) [4, 6]. Так, для связи ЫН...О между двумя амидными группами эта энергия, рассчитанная по данным табл. 9.4, составляет 21 кДж-моль-1 (5 ккал-моль-1) [3]. Связи, характеризующиеся такой энергией, имеют особое значение, поскольку они достаточно стабильны, чтобы обеспечить связывание, и в то же время прочность их невелика, что обусловливает быструю диссоциацию. Если энергия активации, необходимая для разрыва связи, целиком определяется прочностью этой связи, то ее можно рассчитать, воспользовавшись теорией переходного состояния, согласно которой связи с энергией 12,5, 25,0 и 37,5 кДж-моль-1 (3, 6 и 9 ккал-моль-1) разрываются с константами скорости 4 1010, 3 Ю8 и 2 -106 с-1 соответственно.

Далее

Понятие «гидрофобные силы» используется при описании тенденции неполярных соединений, например углеводородов, переходить из водной фазы в органический растворитель. Этот эффект обусловлен не столько прямым взаимодействием между растворителем и растворенными молекулами, сколько перестройкой системы водородных связей в воде в результате присутствия гидрофобного соединения. Чтобы сохранить число водородных связей, каждая из которых имеет энергию 25 кДж-моль-1 (6 ккал-моль-1), молекулы воды располагаются вокруг неполярной молекулы. Поэтому гидрофобное соединение не вызывает больших изменений энтальпии растворителя, но приводит к уменьшению его энтропии из-за увеличения локальной упорядоченности. Вода стремится вновь увеличить свою энтропию, вследствие чего гидрофобная молекула вытесняется в гидрофобную область белка.

Далее

Исходя из простых физических оценок, приведенных в последнем разделе, оценить вклад энергии водородных, электростатических и гидрофобных связей и полную энергию связывания субстрата с ферментом очень трудно. Основная причина этих затруднений состоит в том, что процесс связывания пред ставляет собой реакцию обмена-, субстрат «обменивает» свою сольватную водную оболочку на связывающий центр фермента. Суммарная энергия связывания представляет собой разность между энергиями связывания этого субстрата с водой и с ферментом. Расчет суммарной энергии образования водородных связей затрудняется тем, что обычно в водном растворе субстрат, так же как и фермент, образует с молекулами воды водородные связи. Образование водородных связей в фермент-субстратном комплексе сопровождается вытеснением связанных водородными связями молекул воды. Следовательно, при этом суммарное число водородных связей не увеличивается.

Далее

Функция аминоацил-тРНК—синтетаз состоит в выборе определенной аминокислоты среди других аминокислот и меньших по размеру конкурирующих соединений (гл. 11). В основе отбора нужной аминокислоты лежит, вероятно, то обстоятельство, что ее энергия связывания выше, чем энергия связывания всех других присутствующих соединений. Эти различия в энергии связывания специфического субстрата и меньшего по размеру конкурирующего соединения можно определить из сравнения kcatlKM для реакции обмена Пирофосфат АТР (гл. 7).

Далее

Аминоацил-тРНК — синтетазы обладают исключительно высокой специфичностью. Энергии связывания, полученные для этих ферментов, имеют, вероятно, максимальные из всех принципиально возможных значений. Несколько более низкие значения получаются в случае химотрипсина — фермента, обладающего широкой специфичностью.

Далее

Прочному связыванию метиленовых групп изолейцил- и ва-лил-тРНК—синтетазами способствует еще один фактор. В том случае, когда валин занимает центр связывания изолей-цил-тРНК—синтетазы, в образующемся комплексе остается незаполненная полость, которая была бы занята добавочной метиленовой группой изолейцина в случае его присоединения к ферменту. Ранее указывалось, что энергия дисперсионного взаимодействия метиленовой группы в кристаллическом углеводороде составляет 8,4 кДж-моль-1 (2 ккал-моль-1). Поскольку плотность упаковки белков такая же, как и плотность упаковки кристаллов [23], наличие полости добавляет к энергии гидрофобной связи метиленовой группы еще 8,4 кДж-моль-1.

Далее

Аналогичным образом связывание димера X—У ферментом может быть значительно более прочным, чем связывание мономеров X и У, поскольку димер теряет только один набор поступательной и вращательной степеней свободы.

Далее

Соприкасающиеся поверхности в олигомерных белках (например, в гемоглобине), а также в комплексах белок — белок (например, в комплексе трипсина с трипсиновым ингибитором), хорошо подогнаны и прилегают друг к другу достаточно плотно. Все водородные и ионные связи спарены. Другими словами, поверхности комплементарны друг другу. По-видимому, на этом основано взаимное распознавание белков.

Далее

Как было показано в гл. 2, высокая каталитическая активность многих ферментов обусловливается в значительной мере факторами энтропийной природы, участием в катализе кислых и основных групп фермента и электростатическими эффектами. Важнейшей особенностью ферментов является также их специфичность в отношении субстратов и высокая энергия связывания. В 1930 г. Холдейн высказал предположение, что эта энергия используется для деформации субстрата до структуры продуктов [П. и теоретиками были рассмотрены различные способы использования энергии связывания для понижения энергии активации стадии химического превращения субстрата.

Далее

Все сказанное выше иллюстрирует рис. 10,1, относящийся к случаю простого механизма Михаэлиса — Ментен.

Далее

В следующем разделе мы обсудим вопрос о комплементарное™ фермента переходному состоянию субстрата, используя подразделение энергий активации на две составляющие, одна из которых отвечает стадии химического превращения, а другая равна изменению энергии связывания в ходе реакции.

Далее

Аналогичная ситуация наблюдается и для пепсина. Из табл. 10.1 видно, что /См для гидролиза широкого круга субстратов равна —0,1 мМ. И опять добавочная энергия связывания групп больших по размеру субстратов используется для увеличения /¡cat, а не для уменьшения /См. Таким образом, чем больше по размерам субстрат, тем выше значение kca IKbn.

Далее

Зная механизм органической реакции, можно получить представление о структуре переходного состояния ферментативной реакции, синтезировать соединения, близкие к переходному состоянию субстрата, и сравнить присоединение к ферменту этих соединений с присоединением исходного субстрата.

Далее

Если Км низка, это означает, что фермент-субстратный комплекс находится в термодинамической яме и в ходе реакции необходимо преодолеть энергетический барьер. При высокой Км комплекс поднят на ‘ступеньку термодинамической лестницы».

Далее

Во многих случаях сопоставить Км с физиологическими концентрациями субстратов не представляется возможным, поскольку эти концентрации неизвестны. Одним из ферментов, для которых такое сопоставление возможно, является карбоангид-раза, так как концентрация в крови двуокиси углерода и бикарбоната измеряется довольно просто. В физиологических условиях этот фермент насыщается каждым из указанных субстратов приблизительно только на 6 % и Км для двуокиси углерода слишком высока, чтобы ее можно было измерить [17].

Далее

Итак, мы обсудили в общих чертах, какие каталитические преимущества дает комплементарность фермента переходному состоянию субстрата и высокое значение /См, и увидели, что эта ситуация реализуется на практике. Рассмотрим теперь, какие механизмы используются для достижения этой цели.

Далее

Как было показано в гл. 8, теория индуцированного соответствия хорошо объясняет некоторые явления, наблюдаемые в случае аллостерических ферментов. Эта теория была предложена ранее для объяснения субстратной специфичности для простых (неаллостерических) ферментов. Предполагается, что в отсутствие субстрата фермент структурно не комплементарен переходному состоянию. Однако, поскольку молекула фермента довольно гибкая, а субстрат имеет жесткую структуру, при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом: это означает, что фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата. В классическом варианте концепции деформации считается, что Км возрастает за счет той составляющей энергии связывания, которая отвечает за деформацию субстрата, а в теории индуцированного соответствия — за счет той составляющей энергии связывания, которая отвечает за деформацию фермента.

Далее

Примером такого рода может служить связывание полиса-харидов с лизоцимом. Для осуществления реакции необходимо, чтобы из шести центров связывания — А, В, С, О, Е, Р — молекула субстрата заняла центры О и Е. При связывании с центром О возникает некоторое напряжение, так что увеличение суммарной энергии связывания при этом не происходит. Тримеры и тетрамеры связываются непродуктивно с центрами А, В, С и А, В, С, О соответственно. Однако в случае гексамера выигрыш в энергии связывания при занятии центров Е и И обеспечивает продуктивное связывание его с центрами А, В, С, О, Е, Р.

Далее

Специфичность фермента, заключающаяся в его способности распознавать один из конкурирующих субстратов, не зависит от того, какой из трех перечисленных выше механизмов имеет место. Подробно этот вопрос обсуждается в гл. 11, но по существу все дело здесь в том, что специфичность зависит от бса /См, а напряжение и непродуктивное связывание не влияют на эту величину [уравнения (10.10) и (3.36)]. Из уравнения (10.15) видно, что индуцированное соответствие просто изменяет параметр ксаг/Км для активной конформации фермента в равной мере по отношению ко всем субстратам (т. е. в К раз).

Далее

Индуцированное соответствие: дополнительные группы в больших по размеру специфичных субстратах участвуют в деформации фермента. Меньшие по размеру неспецифичные субстраты присоединяются преимущественно к неактивной форме фермента. Это приводит к уменьшению ксц ввиду уменьшения продуктивного связывания, однако соответственно уменьшается и /См, поскольку энергия связывания не используется для превращения неактивной конформации в активную.

Далее

В физике и технике термин «деформация» (strain) имеет вполне определенный смысл. Подразумевается, что структура объекта физически искажена. Другой, близкий термин «напряжение» (stress) означает, что объект находится в напряженном состоянии, но не разрушен. Используя эти точные физические термины, можно сказать, что в фермент-субстратном комплексе фермент, как правило, деформирован, тогда как субстрат находится в состоянии напряжения.

Далее

Как отмечалось в гл. 7, выявление промежуточных соединений ферментативных реакций потребовало больших усилий. Было установлено, что в физиологических условиях в ходе реакций с участием многих наиболее распространенных гидролитических ферментов и природных субстратов эти соединения не накапливаются (табл. 10.5), в связи с чем механизм действия пепсина и карбоксипептидазы до сих пор не удалось установить.

Далее

Специфичность — чрезвычайно многозначный и зачастую неверно интерпретируемый термин. В энзимологии под ним обычно понимают способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких конкурирующих за активный центр этого фермента субстратов. Именно в этом смысле, например, говорят о специфичности конкретной аминоацил-тРНК—синтетазы по отношению к конкретной аминокислоте и конкретной тРНК. Таков смысл понятия «специфичность» в применении к биологическим системам. При этом рассматривается ситуация, в которой за фермент конкурируют два субстрата, и ставится задача определения относительной прочности связывания субстратов с данным ферментом. В этом смысле специфичность является функцией прочности связывания обоих субстратов и скорости катализа: если какой-либо субстрат, реагируя с ферментом, имеет константу kcat в 1000 раз меньше, чем kcat для интересующего нас субстрата, но связывается в тысячу раз прочнее, эти два фактора будут компенсировать друг друга. Вот почему важным кинетическим параметром при определении специфичности является отношение kcat/Км . оно отражает оба фактора — скорость реакции и прочность связывания.

Далее

Центральную проблему специфичности можно сформулировать так: каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого, меньшего или равного ему по размеру (изо-стерического) субстрата? Отличить больший по размеру субстрат от специфического субстрата нетрудно, поскольку полость фермента, в которой происходит связывание, может быть достаточно велика, чтобы связать небольшой специфический субстрат, но слишком мала, чтобы в нее поместилась более крупная молекула конкурирующего субстрата. Однако небольшой по размерам субстрат не встречает таких стерических препятствий. В этом случае энергия связывания, используемая в катализе, будет меньше. Такие примеры были рассмотрены в разделе, посвященном сериновым протеазам. Большие по размеру производные ароматических аминокислот не могут связываться небольшим связывающим карманом эластазы в отличие от меньших по размерам производных аминокислот, способных связываться и реагировать с химотрипсином. Однако, как обсуждалось в начале предыдущей главы, реакции с участием меньших по размеру субстратов характеризуются значительно меньшими значениями параметров и бса Дм- Различить субстраты не составляет труда и в том случае, если между ними имеются существенные стереохимические различия. Как указывалось в конце гл. 2, при замене Ь-аминокислоты О-аминокис-лотой происходит такая перестановка двух групп у хирального атома углерода, что продуктивное связывание субстрата становится невозможным.

Далее

Уравнение (11.3) дает максимальный эффект, к которому может привести связывание дополнительной группы. Если при переходе от А к В лимитирующей становится другая стадия, то энергия активации уменьшается на величину, меньшую ДДбь.

Далее

Для анализа вклада энергии связывания в свободную энергию активации для каталитической стадии в общем случае можно использовать следующий формальный термодинамический подход.Разность в энергиях связывания субстратов А и В, ДДбь, входит в уравнение только один раз. ДД(/ь нельзя увеличить, суммируя соответствующие величины для каждой из стадий. Специфичность, обусловленная ДДбь, просто «распределяется» по этим стадиям.

Далее

При образовании смешанных комплексов А и В с ферментом специфичность не может увеличиться в результате одновременного связывания двух молекул субстрата. Связывание А дает больший вклад в скорость каталитической стадии, чем присоединение В к некаталитическому центру, однако в смешанном комплексе ЕАВ связывание А повышает активность в такой же степени, как и в двойном комплексе ЕА.

Далее

Причина, по которой гексокиназа предпочитает фосфорили-ровать глюкозу, а не воду, заключается в том, что глюкоза в отличие от воды хорошо связывается в переходном состоянии. Каким бы ни был механизм этой реакции (деформация или индуцированное соответствие), исход конкуренции между глюкозой и водой будет одинаковым. Если допустить, что Ушах для фосфорилирования глюкозы и воды одинакова, а энергия связывания глюкозы используется на уменьшение Км, то глюкоза будет фосфорилироваться эффективнее благодаря тому, что активный центр предпочтительнее связывает именно глюкозу. Если бы вся энергия связывания глюкозы использовалась для понижения энергии активации стадии, определяющей Ушах, это также привело бы к более эффективному ее фосфорилированию вследствие повышения реакционной способности этого соединения при связывании.

Далее

Ограничения, налагаемые на специфичность различиями в энергии связывания, не обеспечивают должной точности работы некоторых биологических систем.

Далее

Процесс репликации ДНК характеризуется чрезвычайно высокой точностью. Частота мутации для E.coli составляет 10 6— 10-8, и, следовательно, точность репликации ДНК либо равна указанным величинам, либо еще больше [7]. Это подтверждается результатами исследования in vitro ДНК-полимеразы из E. coli и фага Т4, согласно которым вероятность ошибки составляет менее 10-5 [7, 8]. Такая точность обеспечивается сложной системой корректирующих механизмов.

Далее

Основное условие функционирования корректирующего механизма состоит в том, что в ходе реакции должно образовываться легко гидролизующееся промежуточное соединение или продукт.Корректирование осуществляется введением в реакционный путь ответвления, обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений. Как мы видели, в реакции аминоацилирования тРНК с участием аминоацил-тРНК—синтетазы в этом процессе участвует особый гидролитический центр фермента, где гидролизуется неправильно ацилированная тРНК, а возможно, и предшественник аминоациладенилата.

Далее

В этой главе мы рассмотрим механизм действия большинства ферментов, кристаллическая структура которых установлена с высоким разрешением.Особое внимание уделено вопросу о том, как совместное использование данных кинетических и структурных исследований позволяет достаточно полно описать механизм реакций, а также тому, что дало изучение ферментативного катализа для развития представлений о механизме химического катализа. Кроме того, в этой главе рассмотрены некоторые экспериментальные подходы, используемые в энзимологии. К сожалению, мы не касаемся здесь многих весьма интересных по своим свойствам ферментов, поскольку их кристаллическая структура все еще не установлена. Охватить в такой небольшой по объему книге все ферменты невозможно — их число превышает 1500,— и мы включили в данную главу только те из них, для которых можно связать трехмерную структуру с механизмом действия фермента.

Далее

Структура некоторых дегидрогеназ установлена. Эти ферменты, их физические и кинетические свойства подробно рассмотрены в работах [4—8]. Приведенные данные позволяют сделать некоторые выводы. Как говорилось в конце гл. 1, в субъединицах фермента можно выделить два домена: каталитический домен, структура которого существенно различается для разных дегидрогеназ, и домен, связывающий нуклеотид и характеризующийся тем, что его полипептидная цепь уложена одинаковым для всех дегидрогеназ образом. Детали структуры этого домена варьируют от фермента к ферменту, однако во всех случаях кофермент присоединяется в развернутой конформации (рис. 12.1). Наиболее важное изменение касается способа расположения никотинамидного кольца: для ферментов разных классов (А и В) оно обращено к субстрату разными сторонами.

Далее

По мнению других авторов [15], недиссоциированный спирт присоединяется к иону Zп + без замещения молекулы воды; координационное число цинка возрастает до 5.Вопрос о том, обладают ли реакционной способностью все активные центры молекулы алкогольдегидрогеназы или половина их, остается открытым. Хотя этот фермент связывает два моля NAD+ с одинаковым сродством, считается, что в катализе участвует только один активный центр.

Далее

Кристаллическая структура растворимого (цитоплазматического) фермента установлена с разрешением 2,5 А [45]. Карта электронной плотности еще не соотнесена с аминокислотной последовательностью, но, как указывалось в гл. 1, укладка по-липептидной цепи фермента в принципе аналогична укладке цепи лактатдегидрогеназы, хотя малатдегидрогеназа является всего лишь димером с мол. весом 70 ООО. Вероятно, механизм действия обоих ферментов одинаков, поскольку малатдегидрогеназа также содержит важный для катализа остаток гистидина, который может модифицироваться диэтилпирокарбонатом [46]. Два моля NADH (или NAD+) связываются с одинаковым сродством [47]. Кажущаяся отрицательная кооперативность при связывании кофермента, обнаруженная для одного из препаратов фермента, может быть обусловлена тем, что на самом деле в препарате присутствовали две формы [48, 49].

Далее

Структурные исследования позволили дать ясное и вполне разумное с химической точки зрения описание стереохимических и каталитических условий протекания реакции переноса гидрид-иона. В трех из рассмотренных примеров присутствует кислотноосновный катализатор, который образует водородную связь с карбонильной или спиртовой группой субстрата, способствует его правильной ориентации и стабилизирует переходное состояние [схема (12.18)].

Далее

Эти ферменты уже рассматривались нами в разных разделах. Основной материал распределился следующим образом: классификация ферментов, их специфичность — гл. 1, разд. В; структура активного центра, фермент-субстратный комплекс, ацилфермент и комплекс между ферментом и продуктом — гл. 1, разд. Г; кинетика-реакций и установление их механизма — гл. 7, разд. Б; рН-зависимость каталитического процесса и состояние ионизации активного центра — гл. 5, разд. Е и Ж.2.а; использование энергии связывания для увеличения са( — гл. 10, разд. А.4; стабилизация переходного состояния, специфическая сольватация переходного состояния — гл. 10, разд. В.5.в. В этом разделе вкратце рассмотрены все перечисленные вопросы.

Далее

Этот фермент образован единственной полипептидной цепью, состоящей из 212 аминокислотных остатков и имеющей мол. вес 23 406 [95]. Кинетические исследования показали, что активный центр может связать семь аминокислот — четыре с той стороны расщепляемой связи, где находится ацильная группа (подцент-ры S4 — Si), а три — со стороны аминогруппы (Si — S3) [96].

Далее

Центральным моментом механизма действия карбоксипептидазы является вопрос о том, в какой роли выступает остаток 01и-270 — является ли он нуклеофильным катализатором, образующим смешанный ангидрид с субстратом [схема (12.25)], или представляет собой общее основание, которое активирует атаку субстрата молекулой воды [схема (12.26)] [НО].

Далее

Пепсин, мол. вес которого равен 34 644, состоит из единственной полипептидной цепи, содержащей 327 аминокислотных остатков [137, 138]. Ser-68 фосфорилирован, однако удаление фосфата не приводит к существенным изменениям каталитических свойств фермента [139]. Как и у других кислых протеаз, активный центр пепсина занимает обширную область, в которую может поместиться по крайней мере четыре-пять, а возможно, и до семи остатков молекулы субстрата [140, 141]. Наиболее благоприятной для функционирования пепсина является такая ситуация, когда по обе стороны от расщепляемой связи находятся гидрофобные аминокислоты. Статистический анализ процесса расщепления связей в белках показывает, что подцентр Si специфичен к лейцину, фенилаланину, триптофану и глутама-ту (!), а подцентр Si— к триптофану, тирозину, изолейцину и фенилаланину [141]. Пепсин, как правило, не гидролизует эфиры; исключение составляют эфиры L-p-фенилмолочной кислоты и некоторые эфиры сернистой кислоты.

Далее

Циклизация обычно протекает значительно быстрее, чем последующий гидролиз, поэтому промежуточное соединение можно легко выделить. Молекула ДНК рибонуклеазой не гидролизуется, поскольку у нее отсутствует 2 -гидроксильная группа. Фермент высокоспецифичен по отношению к основанию, находящемуся на З -конце: это основание должно быть пиримидином — урацилом или цитозином.

Далее

Показательным примером специфичности по принципу замка и ключа может служить связывание пиримидина с активным центром [171]. Водородные связи с-гидроксильными группами 5ег-123 и ТЬг-45 и ЫН-группой, принадлежащей ТЬг-45, могут образовывать как урацил, так и цитозин [схема (12.40)]. Связывание производных аденозина, имеющих больший размер, приводит к смещению фосфата относительно гистидиновых остатков.

Далее

Для тригонального бипирамидального атома фосфора должен наблюдаться поворот заместителей, что обусловлено перемещением уходящей группы в аксиальное положение [схема (12.43)]. Эта перегруппировка является следствием детального равновесия: нуклеофил атакует по аксиальному положению и, следовательно, уходящая группа должна покинуть это положение (поскольку в ходе обратной реакции она должна атаковать по аксиальному положению).

Далее

Стафилококковая нуклеаза является фосфодиэстеразой, расщепляющей ДНК и РНК с образованием З -фосфомононуклео-зидов.Фермент имеет мол. вес 16 900 и образован единственной поли-пептидной цепью, содержащей 149 аминокислотных остатков. Структура стафилококковой нуклеазы и его комплекса с тими-дин-3 ,5 -дифосфатом была установлена с разрешением 2,0 А [181, 182], и, несмотря на это, механизм действия фермента не известен. Вспомнив об успехах, достигнутых при исследовании рибонуклеазы, и имея в виду все вышесказанное о стафилококковой нуклеазе, можно сделать вывод, что определение структуры фермента не означает, что мы автоматически устанавливаем механизм его действия. И тем не менее данные о кристаллической структуре послужили основой при выяснении механизма действия рассматриваемого фермента.

Далее

Результаты, полученные при исследовании обратной реакции, указывают на наличие механизма общего кислотного катализа с участием 01и-35. Установлено, что скорость реакции спиртов с карбоний-ионом фактически не зависит от их р/(а. Этот факт позволяет предположить, что имеет место катализируемая по механизму общего основного катализа атака карбоний-иона спиртом, и, следовательно, согласно принципу детального равновесия, высвобождение алкоголят-иона из гликозида ускоряется по механизму общего кислотного катализа [200].

Далее

Кристаллическая структура изоферментов В и С человека была установлена с высоким разрешением [211, 212]. Обе формы являются металлоферментами, содержащими один моль цинка, прочно связанного с единственной полипептидной цепью с мол.

Далее

Большинство гликолитических ферментов получено в кристаллическом виде, и их кристаллическая структура установлена. Современное состояние рентгеноструктурных исследований в этой области было освещено Блэйком [226]. К сожалению, аминокислотная последовательность установлена только для нескольких ферментов. Два из них — лактатдегидрогеназа и глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназа — были рассмотрены ранее, в разд. А. Здесь мы остановимся лишь на отдельных интересных вопросах, связанных с некоторыми из этих ферментов.

Далее