В предыдущем разделе было показано, что кинетические исследования с помощью метода оставленной струи дают возможность обнаружить накапливающиеся промежуточные соединения. Стационарная кинетика не позволяет прямо выявить эти соединения, она дает лишь косвенные данные. Окончательный ответ на вопрос зависит от результатов прямых измерений с привлечением данных предстационарной кинетики. Однако стационарная кинетика позволяет выявить ненакапливающиеся промежуточные соединения и, основываясь на данных тех эспериментов, когда накопление происходит, доказать их существование и выяснить природу.[ ...]
Для выявления промежуточных соединений с помощью стационарной кинетики необходимо, чтобы имело место накопление а) промежуточного соединения, способного взаимодействовать с акцептором (или желательнее с несколькими различными акцепторами), концентрация которого (или которых) может изменяться; б) общего для нескольких субстратов промежуточного соединения Е—И, образуемого субстратами, каждый из которых содержит фрагмент И; это промежуточное соединение должно обладать способностью взаимодействовать с различными акцепторами.[ ...]
Если образующееся промежуточное соединение может реагировать с различными акцепторами, то для его обнаружения можно использовать два подхода.[ ...]
Первый подход состоит в определении соотношения, в котором образуются продукты. Например, гидролиз химотрипсином серии эфиров гиппуровой кислоты в растворе гидроксиламина ведет к образованию свободной гиппуровой кислоты и гиппу-рилгидроксамовой кислоты в постоянном соотношении (табл. 7.2). Неферментативный гидролиз в тех же условиях приводит к разному соотношению между продуктами [24, 25].[ ...]
Это четко указывает на наличие общего промежуточного соединения.[ ...]
Второй подход состоит в измерении скорости образования продуктов гидролиза определенного субстрата при разных концентрациях акцептора. Это дает информацию о лимитирующей стадии процесса и о природе промежуточного соединения. Предположим, что лимитирующей стадией является образование ацилфермента. В таком случае, поскольку акцептор реагирует с ацилферментом после лимитирующей стадии, он не может увеличить скорость гидролиза эфира. Суммарная скорость образования продуктов будет такой, как показано на рис. 7.2. Если лимитирующей стадией является гидролиз ацилфермента, то акцептор будет увеличивать скорость этой реакции и, следовательно, суммарную скорость образования продуктов (рис. 7.3).[ ...]
Итак, очевидно, что исследование соотношения между продуктами является мощным методом обнаружения промежуточных соединений.[ ...]
Вернуться к оглавлению