Ни постоянство величины Ушах, ни постоянство соотношения между образующимися продуктами еще не доказывают присутствия промежуточного соединения. Например, оказалось, что в случае щелочной фосфатазы постоянство значения Fmax является артефактом, а кроме того, нельзя сказать a priori, что атака комплекса Михаэлиса акцепторами также не даст постоянного соотношения между образующимися продуктами. Для того чтобы из указанных экспериментов можно было сделать четкий вывод о наличии промежуточного соединения, их необходимо связать с измерением скоростей. При измерении скоростей в рамках стационарной кинетики наиболее благоприятной является такая ситуация, когда промежуточное соединение накапливается. Если выполняются уравнения (7.4) — (7.6), можно сделать четкий вывод о существовании промежуточного соединения. Чрезвычайно полезно сочетание опытов по установлению распределения продуктов с исследованиями предстационарной кинетики (как это было сделано в случае химотрипсина и амидов).[ ...]
В ряде ситуаций простые правила распределения промежуточных соединений перестают выполняться. Если акцептор-нуклеофил реагирует с ацилферментом до того, как успевает произойти диффузия уходящей группы от фермент-содержащего промежуточного соединения, то распределение может зависеть от природы уходящей группы (т. е. обусловливаться стериче-ским затруднением атаки и т. д.). Кроме того, измерение констант скорости атаки нуклеофилами промежуточного соединения может привести к не совсем верным результатам вследствие упоминавшихся выше эффектов неспецифического связывания.[ ...]
Вернуться к оглавлению