Чаще всего к ошибкам приводит невыполнение закона Ламберта—Бэра. Такая ситуация возникает по ряду причин.[ ...]
Некоторые соединения способны поглощать свет, а затем испускать его (но уже с большей длиной волны). Это явление называется флуоресценцией. Эффективность процесса характеризуется квантовым выходом <7, который равен отношению числа испускаемых квантов к числу поглощаемых (<7 всегда меньше единицы). К природным флуорофорам относится КАОН, поглощающий свет с % = 340 нм, а испускающий — с К = 460 нм, Основной флуорофор в белках — триптофан — поглощает в области 275—295 нм, а испускает свет с К = 330—340 нм. Слабо флуоресцирует в этой же области и тирозин. В основе многих синтетических субстратов эстераз, фосфатаз, сульфатаз и гли-козидаз лежит 4-метилумбеллиферон — сильно флуоресцирующее производное фенола.[ ...]
Хотя интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света, невозможно до бесконечности уменьшать концентрацию флуоресцирующего соединения, компенсируя это уменьшение увеличением интенсивности возбуждающего света. Это связано с наличием рассеяния света — рэ-леевского, при котором рассеянный свет имеет ту же длину волны, что и падающий, и рамановского, при котором длина волны рассеянного света иная; все это существенно уменьшает интенсивность падающего света. Кроме того, при высокой интенсивности возбуждения исследуемое соединение может подвергаться фотолизу.[ ...]
Флуоресценция наблюдается в том случае, когда фотон поглощается соединением (которое переходит в возбужденное состояние с временем жизни 10 не), а затем испускается им. Однако молекула, находящаяся в возбужденном состоянии, может потерять свою энергию, столкнувшись с другой молекулой (например, с иодид-ионом) или передав энергию другой группе той же молекулы. В таких случаях говорят, что произошло тушение флуоресценции. Исследование тушения флуоресценции триптофана в составе белка при связывании субстратов является весьма ценным способом оценки степени связывания. Интенсивность флуоресценции может не только уменьшаться, но и увеличиваться. Например, соединение, лишь слабо флуоресцирующее в водном растворе, зачастую интенсивно флуоресцирует при переносе в неполярную среду. Таким свойством обладают, например, красители толуидин- и нафталин-сульфоновые кислоты — при связывании в гидрофобных карманах белков они начинают сильно флуоресцировать. Интересно, что, если эти красители связываются в молекуле белка рядом с триптофановым остатком, они могут возбуждаться светом, поглощенным триптофаном, т. е. светом с к = 275—295 нм, в результате переноса энергии с триптофана на краситель. В воде триптофан и ИАОН флуоресцируют слабо, однако их флуоресценция усиливается, когда они находятся в неполярных областях молекулы белка.[ ...]
Истинную интенсивность флуоресценции можно вычислить, исходя или из этого уравнения, или из более сложного, куда введены соответствующие поправки, а также с помощью стандартных кривых [1].[ ...]
Вернуться к оглавлению