При проведении равновесной гель-фильтрации колонку уравновешивают раствором лиганда и наносят образец фермента, уравновешенный буферным раствором. Проходя через колонку, белок связывает лиганд и перемещает его с такой же скоростью, с какой движется сам. В результате положение пика, соответствующего выходу лиганда из колонки, совпадает с положением пика, отвечающего белку, тогда как впадина на кривой находится в области, обычно занимаемой небольшими молекулами. Площадь под пиком равна площади впадины и соответствует количеству связанного лиганда.[ ...]
Достоинство этого метода состоит в том, что фермент находится в контакте с данной молекулой лиганда очень недолго, и, следовательно, метод может использоваться в тех случаях, когда фермент медленно гидролизует лиганд. Еще одним преимуществом данной методики является то, что имеющиеся гели позволяют разделять молекулы по размерам; это, например, дает возможность исследовать связывание тРНК (мол. вес 25 000) аминоацил-тРНК—синтетазой (мол. вес 100 000) [8].[ ...]
Рассмотренный метод позволяет работать с микроколичествами препаратов. При связывании небольших лигандов удобно использовать туберкулиновый шприц объемом 1 мл, заполненный сефадексом G-25. В шприц вводят образец объемом 100 мкл и каждую каплю (объемом 35—40 мкл) собирают в пробирку. Для измерения объема капель их втягивают в шприц. Однако при разделении белка и крупного лиганда приходится использовать колонки значительно большего размера (типичный пример — колонка размером 0,7X18 см, применяющаяся для разделения тРНК и тРНК—синтетазы).[ ...]
Вернуться к оглавлению