Экология СПРАВОЧНИК

Во всех возможных случаях для подсчета числа местных поражений используются виды растений-хозяев, реагирующие на заражение вирусом образованием отчетливо выраженных некрозов или реакцией типа кольцевой пятнистости (цветная вклейка 1 и фото 35). Некоторые вирусы вызывают образование хорошо воспроизводимых хлоротических поражений, однако в других случаях Taime поражения могут варьировать от четких пятен до неясных желтых зон, оценка которых оказывается произвольной и субъективной. При этом иногда удается использовать тот факт, что содержание крахмала в клетках пораженного участка может отличаться от содержания его в неинфицироваиных клетках [815]. В конце светового периода инфицированные вирусом клетки могут содержать меньше крахмала, в конце тем-нового — больше. Чтобы выявить подобные участки, листья обесцвечивают этанолом и окрашивают иодом. Для получения удовлетворительных и воспроизводимых результатов при выявлении некрозов с помощью иод-крах-мальной пробы необходимо тщательно контролировать условия окружающей среды и время взятия образцов.

Далее

До того как Холмс [814] предложил метод подсчета местных поражений, единственным способом определения инфекциоиности, имевшимся в распоряжении исследователей, было заражение нескольких групп растений образцами различного разведения и последующая регистрация растений с системным поражением. Этот способ занимает много времени и требует гораздо большего числа растений для получения надежных данных. Однако в отдельных случаях такой метод определения инфекциоиности используется и сейчас, например в отношении вирусов, которые не имеют растений-хозяев с хорошо выраженной местной некротической реакцией, или вирусов, переносимых насекомыми.

Далее

Вирусы растений имеют такие размеры, которые делают очень удобным их анализ с помощью аналитического ультрацентрифугирования. Этот метод особенно полезен для контроля этапов очистки вируса, а также для изучения влияния различных обработок на физическое состояние вирусных частиц и определения количества вируса в неочищенном экстракте ткани. При использовании шлирен-оптики обычно можно обнаружить вирус в концентрации около 100 мкг на 1 мл. Иногда удается работать с вирусом даже при концентрации 50 мкг на 1 мл. Верхний предел концентрации отчасти зависит от вируса, а также от скорости центрифугирования. При концентрации вируса, составляющей 3—4 мг/мл, возможно зашкаливание, так что появляется черная линия, пересекающая пик. Оптимальными являются условия, при которых концентрация каждого компонента находится в пределах 0,5—2 мг/мл.

Далее

Метод центрифугирования в градиенте плотности, разработанный Брак-ке [259, 200, 202, 265], можно использовать как для выделения, так и для получения количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось, этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время широко используется в области вирусологии и молекулярной биологии. При проведении исследований методом центрифугирования в градиенте плотности центрифужную пробирку частично наполняют раствором, плотность которого уменьшается в направлении от дна к мениску. Для создания градиента при фракционировании вирусов растений наиболее часто используют сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут быть либо распределены во всем объеме раствора, либо нанесены на вершину градиента. Бракке [262] предложил три различных приема центрифугирования в градиенте плотности. При изопикпическом (равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор, пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность среды равна их собственной плотности. Таким образом, фракционирование частиц нроисходит в этом случае в соответствии с различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают достаточной плотностью для изопикнического разделения многих вирусов. При скоростном зональном центрифугировании вирус сначала наносят па предварительно созданный градиент. Частицы каждого типа седиментируют при, этом через градиент в виде зоны, или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и плотности. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное центрифугирование сходно со скоростным зональным центрифугированием, по в этом случае центрифугирование продолжается до достижения изопикнического состояния. Роль градиента плотности при скоростном центрифугировании заключается в том, чтобы препятствовать конвекции я фиксировать различные виды молекул в определенных зонах. Теория центрифугирования в градиенте плотности сложна и не совсем понятна [262]. На практике же это простой и изящный метод, который широко применяется при работе с вирусами растений. Для этого необходимы лишь высокоскоростная препаративная ультрацептрифуга типа вртсо Б50 и соответствующие бакет-роторы.

Далее

Особенности серологических реакций, применяемых при изучении вирусов растений, обсуждаются в гл. XV. Здесь же мы рассмотрим методы, с помощью которых взаимодействие между вирусным антигеном и специфическим антителом можно использовать для количественного анализа вирусов.

Далее

В этом случае готовится серия двукратных разведений образцов вируса в 0,14 М ]ЯаС1. Равные объемы разбавленной антисыворотки добавляют в каждую пробирку, содержимое встряхивают и инкубируют при 30—37°С. Затем отмечают предельное разбавление каждой пробы, при котором образуется видимый преципитат. Применительно к мелким сферическим вирусам растений этот метод дает хорошо воспроизводимые результаты. Однако при работе с палочкообразпыми вирусами чем более агрегирован препарат, тем меньше вируса требуется для образования видимого преципитата.

Далее

Положение а-оптимума довольно строго пропорционально разведению реагентов (фиг. 70). На этом основывается его использование в качестве количественного теста. При применении этого метода готовят серию двукратных разведений вируса. Затем в каждую пробирку добавляют антисыворотку определенного разбавления и содержимое перемешивают как можно быстрее. Первая пробирка, в которой образуется видимый преципитат, фиксируется как а-оптимум. Если аптисыворотка была оттитрована с вирусом, абсолютная концентрация которого известна, то результаты определения а-оптимума можно перевести в приблизительную концентрацию вируса на 1 мл. Положение а-оптимума в том случае, когда объектами исследования служат палочкообразные вирусы, вероятно, в значительной мере зависит от степени агрегации вирусного препарата. Следует отметить, что копрецшштация компонентов хозяина, по-видимому, сильнее влияет на положение а-оптимума, чем на определение точки предельного разведения при преципитации вируса. Положение а-оптимума нельзя использовать для оценки концентрации штаммов вируса, пользуясь антисывороткой к одному из них, если только они не близкородственны серологически.

Далее

Для оцепки концентрации сферических вирусов [1179] можно использовать минимальное время, необходимое при нормальных условиях для образования видимого преципитата. Уиткомб и Блэк [1899] и Уиткомб [1900], работая с вирусом раневых опухолей, применили этот способ для получения количественных данных с помощью метода кольцевой преципитации, для чего потребовалось гораздо меньше материала.

Далее

Количество вируса в специфических преципитатах можно измерить несколькими способами: путем определения общего азота, выделения 1-г определения нуклеотидов из вирусной рибонуклеиновой кислоты и, наконец, измерения радиоактивности. С помощью этих методов мояшо точно оценить концентрацию вируса, на которую при исследовании палочкообразных вирусов степень их агрегации не влияет вовсе или влияет весьма незначительно.

Далее

Чувствительность реакции преципитации определяется минимальным количеством антигена, способного образовать видимый преципитат. Чем меньше молекула антигена, тем большее его количество требуется для проявления реакции. Било разработано несколько различных методов, в которых вирус перед реакцией с аптисывороткой адсорбируется па значительно больших по размеру частицах или эритроцитах. Чувствительность подобного рода методов выше, чем обычной реакции преципитации, однако пи один из них не получил до сих пор широкого распространения. Например, Сайт о и Мвата 11472] использовали метод адсорбции очищенного вируса штрихова-той мозаики ячменя па эритроцитах овцы, обработанных Таллином. С помощью этого метода можно было тестировать даже такое незначительное количество вируса, как 0,01 мкг.

Далее

Не очень точную, но быструю информацию об относительном содержании вирусных частиц в препаратах можно получить путем применения метода контрастирования вирусных частиц фосфовольфрамовой кислотой и последующего анализа препаратов в электронном микроскопе. Чтобы точно определить число вирусных частиц с помощью электронного микроскопа, необходимо знать объем исследуемого раствора и суметь сосчитать все частицы, находящиеся в этом объеме. Бекас и Вильямс [58] описали метод, согласно которому образцы вирусов разбавляются растворами, содержащими летучие соли (ацетат или карбонат аммония). Затем вирусный препарат смешивают с раствором, содержащим частицы полистиролшого латекса какой-то определенной концентрации, а также известной и однородной формы. Смесь распыляют с помощью пульверизатора на пленку-подложку, которая должна находиться на таком: расстоянии от пульверизатора, чтобы микрокапли попадали именно на нее. Капли должны быть достаточно мелкими, чтобы их можно было легко различить в электронном микроскопе при увеличении, необходимом для идентификации вирусных частиц (около х Ю 000). Можно использовать капли диаметром 5—10 мкм, но капли диаметром в пределах 1—3 мкм предпочтительнее. На фото 2 представлена электронная микрофотография капли, используемой для такого анализа.

Далее

Если в ткань, где размножается вирус, ввести радиоактивный изотоп а2Р в виде ортофосфата, то вирусная РНК оказывается моченой. Для этого либо целое растение выращивают на питательной среде, содержащей меченый ортофосфат (в результате чего он попадает в растение через корни), либо ткань погружают в раствор изотопа. Аналогичным образом для метки вирусного белка можно использовать а53-сульфат. Эти два изотопа довольно дешевы, и их высокая удельная активность в ткани достигается легко. При ■определенных условиях их можно использовать для определения очень небольших количеств вируса. Описанный ниже эксперимент с ВЖМТ в листьях китайской капусты иллюстрирует этот метод.

Далее

Метод, который применялся в вирусологии еще до того, как был выделен; первый вирус, основывается на явлении анизотропии в потоке. Растворы палочкообразных, вирусов достаточно высокой концентрации становятся анизотропными при перемешивании жидкости. Перемешивание вызывает ориентацию частиц в направлении тока жидкости. Явление анизотропии в потоке наблюдается при встряхивании или при вращении жидкости! в небольшом сосуде, расположенном между скрещенными поляроидными пластинками. Это грубый, но быстро дающий результаты метод для выявления в неразрушенном состоянии таких вирусов, как ВТМ или Х-вирус картофеля, в растворах, содержащих более чем 100 мкг вируса на 1 мл.. Было описано несколько экспресс-методов количественного определения вирусов. Эти методы обычно разрабатывают и применяют в работе с вирусами, которые накапливаются в высокой концентрации. К сожалению, к этой категории относятся вирусы, для количественного определения которых уже существуют другие вполне удовлетворительные методы. Например, применительно к ВТМ был описан метод экстракции дисков зараженной, ткани с помощью смеси воды с хлороформом [1741]. Вирус осаждали сульфатом аммония при 25%-ном насыщении, осадок растворяли и измеряли поглощение при 260 нм. Таким образом удалось определить содержание ВТМ в одном диске диаметром 9 мм.

Далее

В табл. 2 суммированы сведения относительно минимальных концентраций и количеств вируса, определяемых с помощью различных методов. Эти оценки очень приблизительны, поскольку они значительно варьируют у разных вирусов и зависят от условий проведения анализа. Тем не менее эти-данные позволяют подчеркнуть широкие различия в чувствительности-разных методов.

Далее

В процессе разработки процедуры выделения очень важно иметь возможность произвести определение инфекциоиности во фракциях. Конечно, лучше всего для этой цели использовать растения, реагирующие на заражение вирусом образованием местных поражений. В ходе предварительных анализов большая точность обычно необязательна, однако надежность и быстрое развитие некрозов дают большие преимущества в работе. В отсутствие растений-хозяев с подобного типа реакцией для количественного определения вирусов можно использовать растения, реагирующие на заражение возникновением симптомов системного поражения. В тех случаях, когда метод механической инокуляции не может быть использован, растения зара-я ают с помощью насекомых-переносчиков.

Далее

Так, Франки [546] показал, что экстракты листьев огурца при смешивании с очищенным вирусом огуречной мозаики снижают инфекционность этого вируса в 100 раз. В присутствии ингибирующих веществ происходит осаждение вируса.

Далее

К средам для экстракции часто добавляют восстановители (сульфит натрия, тиогликолят натрия или цистеингидрохлорид). Эти соединения ■способствуют сохранению инфекционности, которую вирус легко теряет в окислительных условиях, а также уменьшают адсорбцию на вирусе компонентов клетки-хозяина. Как это показано в гл. XIV, фенольные соединения, встречающиеся в растительных тканях, могут серьезно затруднять выделение и хранение вирусов. Ниже приведены некоторые методы, которые более или менее успешно использовались для того, чтобы во время выделения «вести к минимуму действие фенолов на вирусы растений.

Далее

Для измельчения или гомогенизации небольших количеств инфицированной вирусом ткани пользуются ступкой и пестиком, для-работы с более значительными количествами материала используются различные типы гомогенизаторов и соковыжималок. Если требуется переработать до нескольких килограммов ткани, применяются шаровые и коллоидные мельницы, а также мясорубки. При использовании специальной среды для экстракции часто, необходимо обеспечить непосредственный контакт разрушенных клеток с этой средой. Измельченная ткань обычно отжимается через марлю или другую ткань.

Далее

В неочищенном экстракте вирус смешивается с различными клеточными компонентами, размеры которых колеблются в тех же широких пределах, что ж размеры вируса, и свойства которых в некоторых отношениях напоминают свойства вируса. К этой категории частиц относятся рибосомы, 19в-болок хлоропластов (фракция I), имеющий тенденцию образовывать агрегаты, фитоферритин [407], фрагменты мембран и фрагменты разрушенных хлоропластов. В этой смеси присутствуют также неразрушенные клетки, растворимые белки и вещества с низкой молекулярной массой.

Далее

Центрифугирование при высокой скорости в течение достаточного периода времени приводит к осаждению вируса. Если при этом вирус не денатурирует, то его можно затем перевести в активной форме обратно в раствор. Этот этап выделения очень важен, так как он преследует сразу две цели. Во-первых, при этом происходит концентрирование вируса, а во-вторых, препарат вируса освобождается от низкомолекулярных примесей. Не следует применять при центрифугировании растворы вирусов в низкой концентрации, так как это приводит к значительным потерям (фиг. 3).

Далее

Вирусные препараты, прошедшие одну стадию очистки и концентрирования, еще содержат некоторое количество низко- и высокомолекулярных веществ, происходящих из ткани хозяина. Большая часть этих примесей может быть удалена на дальнейших стадиях очистки. Метод, который следует при этом использовать, в значительной степени зависит от стабильности вируса, количества выделенного препарата и цели, для которой требуется препарат.

Далее

При недостаточно адекватных условиях седиментации зоны главного и минорного компонентов могут перекрываться [206]. Способ удаления зон из градиента также может заметно влиять на степень загрязнения одной фракции другой. При фракционировании путем сбора фракций после прокалывания дна порбирки может произойти довольно сильное смешивание, если скорость вытекания слишком высока. Эффективным материалом для создания градиента в случае достаточно стабильных вирусов являются также концентрированные растворы таких солей, как тартрат калия или хлористый цезий.

Далее

При использовании этого метода, примененного Бракке [261] для работы с вирусами растений, суспензия вируса наслаивается па соответствующим образом забуфереш-шй градиент плотности, формируемый в и-образной трубке. Макромолекулы с различным общим зарядом мигрируют с различной скоростью и при соответствующих условиях разделяются, образуя дискретные полосы, которые можно выявить по данным светорассеяния и затем изолировать с колонки. Этот метод пе получил широкого распространения, но может оказаться полезным для нестабильных вирусов. Описаны различные модификации аппаратов, используемых для электрофореза 11(373, 18281.

Далее

Электрофорез на агаровом, крахмальном геле и т. д. не находит широкого применения для исследования вирусов растений. Мало применялся также метод непрерывного электрофореза, при котором поперек листа висящей фильтровальной бумаги прикладывается разность потенциалов. Через лист сверху вниз протекает буфер. Этот метод не нашел широкого применения, что, по-видимому, обусловлено невозможностью разделения больших количеств материала, слишком большой затратой времени и другими причинами.

Далее

Фильтрование через агаровый гель можно рассматривать как полезный этап для дальнейшей очистки вирусов, которые оказываются нестабильными при осаждепии путем высокоскоростного центрифугирования [5, 342, 1672]. Этот метод применяется также для разделения частиц различной длины, встречающихся в препаратах таких палочкообразных вирусов, как ВТМ [1670]. Фракции вируса, полученные с колонки агарового геля, могут содержать также некоторое количество компонентов клетки-хозяина, сходных по размеру с вирусом, для удаления которых требуется некоторая дополнительная обработка. Вирус получают в объеме жидкости, по крайней мере в два раза превышающем объем исходного материала, и обычно требуется проводить концентрирование элюата.

Далее

Иногда как эффективный этап дальнейшей очистки частично очищенных препаратов вируса используют хроматографические методы. Например, для очистки вируса некротического пожелтения салата-латука Мак-Лин и Франки [1127] использовали метод хроматографии на колонках с калъций-фосфатным гелем в фосфатном буфере. При элюции фосфатным буфером (pH 7,6) вирус проходит через колонку, в то время как большая часть примесей остается адсорбированной на геле. В таких условиях с колонки элюировали 50—80% инфекционного вируса, что составляло лишь 10% нанесенного на колонку материала, поглощающего при 260 нм.

Далее

На различных стадиях выделения вируса возникает необходимость сконцентрировать вирусный препарат и удалить из него соли или сахарозу. Для вирусов, которые стабильны при осаждении, с целью концентрирования вируса и удаления низкомолекулярных примесей обычно применяют высокоскоростное центрифугирование, а для удаления или смены солей используют обычный диализ. Для работы с нестабильными вирусами применяют некоторые другие приемы. К препарату можно добавить порошок сухого геля (например, сефадекса) или поместить препарат в мешочек для диализа, обложенный порошком сухого геля, и оставить на холоду в течение нескольких часов. Для концентрировапия больших объемов и удаления солей можно применить ультрафильтрацшо под давлением через мембранные фильтры. Испарение, которое происходит в то время, когда препарат вируса находится в мешочке для диализа и висит в токе воздуха, может вызвать потери вируса вследствие локального подсушивания стенок мешка и концентрирования в таких местах солей, имеющихся в препарате. Для концентрирования очищенных препаратов ВТМ применяются также бактериальные фильтры из пористого стекла с размером пор 1,0—1,7 мкм [1308]. Задержка вируса на фильтре зависит от концентрации соли и обусловлена, по-видимому эффектом высаливания и адсорбцией вируса на поверхности стекла. Далее вирус элюируют с фильтра водой.

Далее

Выбор метода для определения чистоты препарата вируса зависит от цели экспериментов. Наиболее часто препараты вируса выделяют для двух основных целей: 1) установления идентичности и общей природы вирусных частиц, связанных с каким-то определенным заболеванием, 2) проведения детальных физических или химических исследований этих частиц и их компонентов.

Далее

При работе с вновь выделенными вирусами или при попытках выделить их главной задачей является очистка вируса, которая была бы достаточной для того, чтобы идентифицировать инфекционные частицы и по крайней мере предварительно охарактеризовать их. Наиболее удобным в этом случае является метод центрифугирования очищенных препаратов в градиенте плотности сахарозы. После фракционирования можно определить иифек-ционность либо в каждой отдельной фракции, собранной из градиента, либо комбинируя их, если присутствует многокомпонентный вирус. Далее можно снять спектр поглощения в ультрафиолете и исследовать образцы в электронном микроскопе с целью обнаружения характерных частиц. При этом можно пользоваться методом подсчета в капле, который позволяет выявить количественную связь по всему градиенту между инфекционностыо и присутствием во фракциях характерных частиц вируса. Открытие многокомпонентных вирусов, которые описаны в гл. VIII, привело к тому, что оказалось необходимым в первую очередь осторожно интерпретировать результаты, полученные после центрифугирования в градиенте сахарозы (или в других градиентах). Одним из преимуществ экспериментов в градиенте сахарозы является возможность применения относительно небольших количеств вируса. Кроме того, в этом случае можно получить приблизительную оценку коэффициентов седиментации исследуемых веществ. О том, как используется градиент плотности сахарозы для характеристики многокомпонентных вирусов, можно узнать, взглянув на фиг. 39.

Далее

В вопросе, связанном с определением концентрации вируса в растении, еще много сложного и неясного.Часто при выделении вируса различное, но достаточно большое количество его остается связанным с клеточным детритом или с пузырьками и органеллами к летай. Некоторые вирусы, особенно палочкообразные, образующие в клетке крупные, типа волокон, включения, могут остаться агрегированными па первоначальных стадиях выделения. Степень потери вируса под влиянием этого фактора часто в достаточной мере не учитывается.

Далее

Желтой жилки винограда (родствен вирусу Фасоль обыкновен- 15 [601].

Далее

На фиг. 3 суммированы данные о валовом выходе ряда вирусов растений, для которых такие определения проводились. В литературе не имеется данных о выделении вирусов, выход которых был бы меньше чем 0,5 мкг па 1 г. Почти все методы, используемые в настоящее время при выделении вирусов, включают один или более циклов дифференциального центрифугирования, Маркхэм (1147, 1151] теоретически рассмотрел те недостатки метода седиментации, которые возникают при исследовании очень разбавленных растворов макромолекул. В таких условиях на седиментограмме не может сформироваться граница и наблюдается конвекционный тип седиментации. При этом скорость уменьшения концентрации в надосадочной жидкости падает с течением времени по экспоненциальному закону.

Далее

Мелкие вирусы растений, описанные до сих лор, содержат одпоцопочеч-ную или двухцепочечную нуклеиновую кислоту, заключенную в белковую оболочку. Структурный белок состоит из целого ряда правильно упакованных идентичных субъединиц небольшого размера (молекулярная масса обычно « 20 ООО). Некоторые мутанты вирусов, изолированные в лаборатории, по синтезируют функциональный структурный белок. Сообщалось также о двух встречающихся в естественных условиях вирусах, которые содержат только «голую» РНК (.45(3, 1540, 1001]. В состав некоторых вирусов растений входят такие вещества, как полиамины и липиды. В этой главе мы рассмотрим вопросы, касающиеся выделения и некоторых свойств различных компонентов, входящих в состав вирусов.

Далее

В настоящее время совершенно очевидно, что, применяя различные физические и химические агенты, можно удалить вирусный белок и выделить инфекционную РНК при условии, что 1) еще в интактной вирусной частице РНК была инфекционной, 2) во время выделения не применялись бы крайние значения pH среды и 3) РНК была бы защищена от действия нуклеаз. Методы, которые используются для удаления вирусного белка, иллюстрируют стабильность вирусов в отношении различных химических и физических обработок. Другие аспекты этой проблемы обсуждаются в гл. XIV.

Далее

В состав РНК вирусов растений, как и других РНК, входят фосфат, D-рибоза, а также два пуриновых (аденин и гуанин) и два пиримидиновых (цитозин и урацид) основания. Подобно РНК из других источников, их остов построен из чередующихся фосфатных и рибозных остатков, соединенных 3 ,5 -фосфодиэфирной связью. К,Г-атому углерода каждого остатка сахара присоединено одно и« азотистых оснований. Всего таких оснований в РНК четыре: два пуриновых и два пиримидиновых. РНК вирусов растений использовали в качестве объекта в тех основных исследованиях, которые внесли большой вклад в наши знания о структуре РНК в целом [1154—1156].

Далее

В настоящее время инфекционную РНК удалось выделить из многих вирусов растений. Инфекциопность РНК, отнесенная к инфекционности интактного вируса, сильно варьирует в зависимости от вируса и от метода выделения РНК (табл. 5).

Далее

Ранее предполагали, что РНК ВТМ состоит из нескольких сходных или идентичных субъединиц, каждая из которых обладает ипфекщгонностыо. Различного рода эксперименты с очевидностью показали, что инфекциои-ность обеспечивается всем РНК-геномом в целом.

Далее

Подобно другим нуклеиновым кислотам, РНК вирусов растений поглощает в ультрафиолетовой области между 230 и 290 нм, что в основном обусловлено пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. В результате суммирования максимумов поглощения отдельных оснований образуется сильный пик вблизи 260 нм с впадиной около 230—235 пм. Спектр поглощения в ультрафиолете обычно мало полезен, если требуется отличить одну вирусную РНК от другой. Однако в случае РНК, подобных РНК ВЖМТ, характеризующейся высоким содержанием цитидиловой кислоты (максимум поглощения примерно при 280 нм), спектр поглощения в ультрафиолете заметно отличается от спектра поглощения РНК с более обычным составом, например РЫК ВТМ.

Далее

При сравнительном изучении поведения ДИК, синтетических полинуклеотидов и природных РНК при нагревании в растворе Доти и др. [469] пришли к выводу, что при определенных условиях РНК содержит многочисленные незначительной длины спиральные участки, образованные спаренными посредством водородных связей основаниями, перемежающиеся с одноцепочечными областями. Молекулы РНК при этом имеют более или менее компактную структуру. Степень спирализации молекулы РНК при стандартных условиях в некоторой степени зависит от состава оснований.

Далее

Известно, что одноцепочечная ДНК бактериофага срХ174 существует внутри вирусной частицы в виде замкнутого кольца [515]. В связи с этим возникает вопрос, могут ли некоторые икосаэдрические или крупные вирусы растений содержать кольцевую РНК. Такая возможность исключается для палочкообразных вирусов, так как в этом случае имеется одиночная нить РНК, расположенная по длине палочкообразной частицы.

Далее

Плавление проводили в буферном растворе 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата натрия при pH 7,0. I — PI-IK ВКР; Л — рибосомная РНК; III — денатурированная РНК ВКР.При нагревании РНК вируса раневых опухолей в 0,15 М растворе NaCl и 0,015 М растворе цитрата натрия наблюдали гиперхромный эффект, который обнаруживается для ДНК; при этом температура плавления (Тш) была очень высока (около 90 °С) и в пределах нескольких градусов поглощение в ультрафиолете резко возрастало [656].

Далее

Хотя различного рода данные свидетельствуют о том, что общепринятая концепция генетического кода является правильной, до сих пор не ослабевает интерес к попыткам непосредственного сопоставления данных химического анализа последовательности оснований в природных информационных РНК и последовательности аминокислот в кодируемых ими белках. Такие данные могут дать интересную информацию, касающуюся природы «мест узнавания» и регуляции считывания полицистронной матрицы, т. е. дать ответ на вопрос как начинается и как заканчивается трансляция матрицы и как осуществляется контроль скорости считывания различных цистронов.

Далее

Результаты более поздних исследований (Щеферд, личное сообщение) позволяют предположить, что ДНК этого вируса является двухцепочечной.

Далее

Многие условия и реактивы, применяющиеся для выделения вирусной РНК, могут быть также использованы для получения вирусного белка, в большей или меньшей степени свободного от РНК. Однако наилучший метод, применяемый для выделения интактной РНК данного вируса, обычно отличается от метода, позволяющего получать удовлетворительные препараты белка. Химическое и физическое состояние получаемого белка широк» варьируют в зависимости от вируса и применявшейся обработки. Можно получить несколько разных типов белковых продуктов: 1) иятактные белковые оболочки вируса, из которых удалена РНК; 2) нативные и в различной степени агрегированные химические субъединицы; 3) необратимо денатурированные белковые агрегаты, нерастворимые в водных растворах. Основным фактором, приводящим к образованию нерастворимых агрегатов, является образование дисульфидных мостиков между цистеииовыми остатками в белковых субъединицах вследствие окисления сулъфгидрилышх груяп. Образование дисульфидных связей между цепями может быть блокировано различными способами.

Далее

Белки всех исследованных до сих пор вирусов растений построены из тех же 20 аминокислот, которые обнаружены в белках кпехохс растений, животных и бактерий.Аминокислотный состав вирусных белков определяют следующим образом: 1) выделяют вирус, не содержащий значительных примесей других белков; 2) удаляют вирусную РНК; 3) гидролизуют белок (обычно с помощью 6 н. НС1) для расщепления его на аминокислоты; 4) фракционируют и определяют отдельные аминокислоты. Триптофан определяют отдельно, при помощи специального метода.

Далее

Кружками указаны места действия трипсина.Знание последовательности аминокислот в капсидном белке ВТМ имеет огромное значение при изучении связи химических изменений РНК с изменениями аминокислотной последовательности калсидных белков мутантов вируса (гл. XIII).

Далее

Известно, что многие крупные вирусы животных содержат липиды, которые, по-видимому, являются частью внешней оболочки, окружающей внутренний пуклеокапсид, содержащий нуклеиновую кислоту. Большинство вирусов растении, интенсивно изучавшихся при помощи химических способов, относится к категории мелких икосаэдрических или палочкообразных вирусов. Ни один из них, вероятно, не содержит липидов. Однако недавно было показано, что некоторые крупные вирусы растений содержат определенное количество липидов.

Далее

Естественно, при этом возникает вопрос, в какой степени липиды, присутствующие в этих вирусах, имеют клеточное происхождение, т. е. являются ли они либо примесью, загрязняющей вирусный препарат, либо-составными компонентами вирусных частиц. Ахмед и др. [11] пришли к заключению, что не более V6 липидов в препаратах вируса желтой карликовости картофеля обусловлено примесью балластных компонентов клетки-хозяина, однако для точного установления этого факта требуются более детальные химические исследования.

Далее

Важное значение, которое имеет вода в живых клетках, хорошо известно, однако иногда забывают, что вирусы в растворе содержат значительное количество связанной воды, причем содержание ее в мелких вирусах равно примерно массе иуклеопротеидного материала частицы. Изучать гидратацию вирусов можно в кристаллах и в растворе.

Далее

Электронная микроскопия оказалась весьма полезной для определения длины и ширины частиц палочкообразных вирусов, в особенности чрезвычайно длинных гибких частиц, которые было бы очень трудно измерить каким-либо иным путем. Тем пе мопсе при оценке результатов таких, измерений следует иметь в виду различного рода трудности и неясности, могущие возникнуть в ходе их, проведения: 1) необходимость точной калибровки увеличения микроскопа; 2) артефакты, вызванные процессом приготовления препарата, особенно при измерении ширины частиц в случае образцов, оттененных металлами; 3) тот факт, что препараты почти всех палочкообразных вирусов содержат частицы одного или более классов, которые короче частицы, обладающей инфекционностыо. Инфекционные частицы сами по себе могут агрегировать конец в конец. Таким образом, палочкообразные вирусы широко варьируют по длине (примеры такого рода приведены в гл. VIII); 4) даже если разделение по классам провести самым тщательным образом, длины частиц, принадлежащих к каждому классу, будут характеризоваться некоторым распределением около среднего. Обычно модальная (наиболее часто встречающаяся) длипа, соответствующая основному пику, содержащему инфекционные частицы, принимается за нормальную длину данного вируса. Часто оказывается невозможным выяснить, являются ли наблюдаемые отклонения результатом ошибки измерений или они отражают истинные колебания длины частиц; 5) высушивание па пленках-подложках может приводить к некоторому сокращению длины палочек.

Далее

ВТМ, вероятно, является наиболее хорошо изученным и наиболее понятным в структурном отношении нуклеонротеидом во всей биологии. Для итого вируса характерна чрезвычайно стабильная структура. Имеются данные о том, что он сохраняет иифекциоиность в нестерильных экстрактах при комнатной температуре в течение 50 лет [1584]. Стабильность обнаженной РНК ВТМ не больше стабильности любой другой одноцепочечной РНК. Следовательно, стабильность этого вируса является следствием взаимодействий между соседними белковыми субъединицами, а также между белком и РНК.

Далее

Брандес и Беркс [270] перечисляют 4 группы нитевидных вирусов, имеющих более или менее гибкие палочкообразные частицы. Мы кратко рассмотрим по одному представителю каждой из этих групп.Этот вирус имеет гибкие частицы длиной около 730 нм. Ширина палочки составляет 10,5 ± 0,3 им [1838], а шаг основной спирали равен в среднем 3,3 нм (фото 10,Б).

Далее

А. Частицы не обрабатывались детергентом. Б. Производилась 15-муиутная обработка; распределение длил коротких палочек оказалось бимодальным. По оси ординат отложено число частиц данного размера по сравнению с общим числам частиц.

Далее

Каждую структурную субъединицу оболочки можно представить как третью часть треугольной грани, так что в оболочке будет 20-3-.7 — 60 Т квазиэквивалеитиых субъединиц. На фото 11 приведены модели простейших икосадельтоэдров, относящихся к двум классам (Р — 1 и Р = 3).

Далее

Этот вирус содержит около 20% РНК, и его частицы имеют форму многогранника. Диаметр частиц на электронных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования, составляет от 26 до 30 нм, что зависит от особенностей приготовления препарата [54, 949]. Детальная структура этого вируса -не выяснена, но он представляет значительный интерес, поскольку некоторые изоляты содержат связанный с этим вирусом вирус-сатоллит, описанный ниже, а также в гл. VIII.

Далее

Результаты исследования электронных микрофотографий и сравнения их с моделями позволили Хёглунду [807] заключить, что ВС, по-видимому, построен из 12 морфологических субъединиц (т. е. Т — 1, Р = 1, а число химических субъединиц в белковой оболочке составляет 60). Такая структура подтверждается и более поздними исследованиями Клуга и Финча (личное сообщение) (фото 16).

Далее

Изучение электронных микрофотографий но методу Маркхэма (стр. 87) позволило предположить, что частицы вируса кольцевой пятнистости табака [351, 1387] и вируса мозаики резухи [8], возможно, представляют собой икосаэдры, для которых характерно наличие 42 структурных субъединиц (тип симметрии 532). Хотя вероятность того, что некоторые изометрические вирусы растений имеют такую структуру, существует, этот факт нуждается в подтверждении и требует более глубокого анализа.

Далее

На основании изучения оптической дифракции они пришли к выводу, что диаметр субъединиц составляет около 9,6 нм. Субъединицы такого размера должны были бы образовать икосаэдр, состоящий из 12 морфологических субъединиц, диаметром около 18 нм, соответствующий по величине наименьшему компоненту. Данные о размере и молекулярной массе хорошо соответствуют предположению о том, что каждая морфологическая субъединица состоит из 5 пептидов. Ряд начинается с частицы, содержащей 60 химических субъединиц, число которых в принципе может последовательно увеличиваться па 18 (три гексамера). Существующие частицы не заполняют все теоретически возможные положения в ряду (компонент t0 состоит из 60 химических субъединиц; ta — 96; Ц — 114; М — 150 и В — 186 субъединиц). Вероятно, капсидный белок идентичен для всех частиц. Однако детальный сравнительный анализ с применением метода «отпечатков пальцев» и серологических методов [1229] был осуществлен только в отношении белка верхнего и нижнего компонентов.

Далее

Билс и Холл [199] исследовали вирус раневых опухолей в электронном микроскопе, используя для этого метод оттенения металлами, а также позитивное и негативное контрастирование. Применяя метод двойного оттенения, они получили некоторые данные о том, что для частиц этого вируса, возможно, характерна икосаэдрическая симметрия. Диаметр частиц на электронных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования, составлял около 62 нм. Центральная часть частицы заметно выделялась при контрастировании уранилацетатом. Это позволяет предположить, что данная область диаметром около 35 нм, на долю которой приходится 20% объема частицы, заполнена РНК. На поверхности частицы можно было наблюдать морфологические субъединицы диаметром около 7,5 нм. Билс и Холл пришли к выводу, что число таких морфологических субъединиц составляет, вероятно, 92. Согласно табл. 8, такая частица должна относиться к классу Р 1, Т—9, а число структурных субъединиц в ней должно быть равно 540.

Далее

Эти вирусные частицы можно отделить от окружающих их мембран путем обработки смесыо хлороформа с бутанолом, и тогда на электронных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования, выявляются некоторые из ожидаемых деталей структуры икосаэдра [578] (фото 18).

Далее

Имеется много штаммов этого вируса, и разные исследователи использовали различные его изоляты для изучения строения частиц либо на тонких срезах листа, либо в изолированных суспензиях вируса, либо, наконец, в исходных экстрактах. Этот вирус нестабилен, в связи с чем его структура до сих пор окончательно не исследована. Судя но препаратам, полученным методом распыления капель, частицы различных штаммов вируса, очевидно, различаются по своей жесткости [189]. В листьях инфицированного растения N. glutinosa с системным поражением Бест [190] обнаружил частицы различной величины и формы. Среди них были округлые, трубчатые и нитевидные частицы, а также можно было наблюдать спиральные нити, которые, возможно, представляли собой вытянутые центральные стержни. Ряд авторов [193, 853, 979, 1825] описали частицы, размеры которых колеблются от 55 до 120 нм. Вероятно, эти колебания в некоторой степени были обусловлены уплощением и разрушением частиц в процессе высушивания. Частицы окружены мембраной толщиной около 5 нм. С внешней стороны мембраны имеется зона белковых субъединиц приблизительно такой же толщины (фото 11), А).

Далее

О характере связей, объединяющих белковые субъединицы друг с другом и РНК с белком в вирусной частице, известно немного.

Далее

Мак-Карти [1118] изучал размеры агрегатов, обнаруживаемых в препаратах А-белка, путем седиментационного анализа, электронной микроскопии и электрофореза в акриламидном геле. Полученные результаты находятся в соответствии с данными о том, что стабильными агрегатами мономеров являются тример, гептамер, двойпой диск из 34 субъединиц, сегмент спирали, состоящий из 3 витков, и димер двойных дисков.

Далее

Наличие РНК внутри белковой спирали ВТМ в значительной степени стабилизирует структуру этого вируса. С каждой белковой субъединицей связаны три нуклеотида спирали РНК. Кислые фосфатные группы, вероятно, нейтрализованы ионными связями с основными группами на поверхности белковой субъединицы, расположенными в желобке, где находится РНК, или поблизости от пего. Минимальное количество полиамина, связанного с ВТМ [894], могло бы нейтрализовать лишь небольшую долю фосфатных групп.

Далее

Причина повышенной устойчивости вирусов, находящихся в семенах, не совсем ясна. Возможно, эта устойчивость обусловлена общим стабилизирующим воздействием па итттактные вирусные частицы, которое оказывают па них низкое содержание воды и высокая концентрация белка.

Далее

Вегетативное размножение представляет собой важный прием, используемый в садоводстве, но, к сожалению, является столь же эффективным способом сохранения и распространения вирусов. Вирусы, наносящие значительный ущерб экономике сельского хозяйства, обладают способностью к системному распространению по большей части вегетативных органов растения, причем растение, однажды системно инфицированное вирусом, обычно сохраняет вирус в течение всего периода своей жизни. Таким образом, любые органы растения, служащие для вегетативного размножения, как, например, клубни, луковицы, клубнелуковицы, усы, черенки, обычно инфицированы вирусами. Во многих случаях каждая исследованная особь какого-либо определенного сорта инфицирована тем или иным вирусом; например, растения некоторых сортов картофеля оказываются зараженными Х-вирусом картофеля. Однако, если заражается здоровое растение размножающегося вегетативным путем вида, причем даже на довольно ранней стадии развития, распространения вируса по растению в течение первого сезона вегетации может и не произойти (гл. VII).

Далее

Прививка по существу представляет собой форму вегетативного размножения, при которой часть одного растения растет на корнях другого. При этом, как только произойдет срастание тканей, подвой ж привой вместе образуют одну особь. В том случае, когда для подвоя или для того растения, часть которого использована в качестве привоя, характерна системная инфекция, привитое растение в целом оказывается зараженным при условии, что оба партнера чувствительны к вирусу. Начиная с первых дней исследования вирусов растений в качестве доказательств вирусной природы: заболевания обычно принимались два рода фактов, а именно возможность передачи заболевания с помощью прививки и отсутствие какого-либо патогенного агента, который можно было бы обнаружить с помощью светового микроскопа. Теперь известно, что многие вирусы, которые, как когда-то считалось, передаются только путем прививки, столь же успешно передаются и другими способами.

Далее

Одним из основных достижений при использовании повилики в эксперименте оказалась возможность передачи с помощью этого растения вирусов от растений-хозяев, где их трудно изучать, на растения, которые удобны для проведения экспериментальных исследований. Что касается полевых условий, то, по-видимому, повилика не играет существенной роли в распространении вирусов, приносящих большой ущерб сельскому хозяйству.

Далее

В природе многие вирусы растений передаются от растения к растению с помощью беспозвоночных-переносчиков. Эта большая самостоятельная тема обсуждается в гл. XVI.

Далее

Относительно половой стадия имеются некоторый сомнения. 1 — зооспора; 2 — зооспорангии в клетках корня; 3 половое слияние; 4 — спорапгия в растительных остатках в почве.Внутри клетки-хозяина цитоплазма гриба оказывается окруженной вновь образованным тонопластом.

Далее

При механической инокуляции инфекционный вирус или вирусная РНК вводятся в клетки через повреждения, вызванные тем или иным способом на поверхности растения. При этом, если вирус способен репродуцироваться в клетке, развивается инфекция. Этот способ передачи вирусов имеет большое значение для многих разделов экспериментальной вирусологии, особенно для различных методов количественного определения вирусов (гл. И), а также при изучении ранних этапов взаимодействия вируса с чувствительными клетками (гл. VII). Использование вирусной РНК в качестве инокулума мы рассматривали в гл. IV, а различные факторы, влияющие на чувствительность растений-хозяев к вирусам, рассмотрим в гл. XII.

Далее

Вирусные частицы, помещенные на неповрежденную поверхность листа, не могут вызвать заражения. Для того чтобы это заражение осуществилось, необходимо как-то поранить лист и сделать таким образом его поверхность восприимчивой. Возможно, некоторые типы клеток, расположенные иа листовой поверхности, более чувствительны к поранению, чем другие. С помощью микрургической техники было показано, что вирусные частицы можно ввести в листовой волосок, однако интенсивность заражения оказывается при этом очень низкой [148, 1981]. Эффективность инокуляции можно повысить, если сделать разрез ткани под каплей раствора вируса в разбавленной желатине. Контаксис и Шлегель [1020], а также Херридж и Шлегель [772] изучали с помощью метода радиоавтографии распределение на поверхности инокули-рованного листа ВТМ, меченного 14С. При этом было обнаружено, что вирус аккумулируется на базальной перегородке разрушенной трихомы. Однако нет никаких оснований полагать, что эти обнаруженные путем радиоавтографии вирусные частицы имеют какое-либо отношение к процессу инфекции. При механической инокуляции огромное количество вируса в инокулуме остается инертным иа поверхности листа. Так, Рэдди [1409] показал, что после промывки на листовой поверхности задерживается около 1/3 частиц ВТМ, нанесенных на лист, причем около 90% адсорбированных вирусных частиц удается извлечь из листа в недеградированной форме через 48 ч после инокуляции. Результаты работ Бойли и Мак-Кинни [233] делают сомнительными предположения, что трихомы играют важную роль в процессе инфекции ВТМ. При осторожном втирании инокулума ВТМ между волосками листа растений перца образуется столько же местных поражений на единицу поверхности, как и в том случае, когда инокулум втирают по всей поверхности листа. Удаление трихом за несколько дней до инокуляции, когда трут поверхность листа, оказывает незначительное влияние на число образующихся при этом местных поражений.

Далее

Нам следует рассмотреть три стороны этого вопроса. Во-первых, какое количество вирусных частиц необходимо нанести на лист, чтобы заражение было успешным? Во-вторых, достаточно ли одной частицы из числа нанесенных, чтобы вызвать инфекцию? В-третьих, могут ли две или более частиц независимо репродуцироваться в одной и той же клетке? Что касается первой стороны этого вопроса, то считается общепринятым, что механическая инокуляция даже в лучших, достижимых в настоящее время условиях весьма малоэффективна. Для таких вирусов, lían ВТМ, необходимо нанести па лист примерно от 10 до 105 частиц, чтобы индуцировать образование каждого возникающего в результате этого местного поражения. Эти данные резко противоречат результатам, полученным в отношении вирусов бактерий, где при благоприятных условиях фактически каждая вирусная частица может заразить чувствительную клетку, а также и в отношении вирусов животных, где для успешного заражения достаточно, как было показано, менее 10 вирусных частиц. Существуют три возможные причини для объяснения ситуации, имеющей место в системах с вирусами растений: 1) низкая эффективность процесса инокуляции; 2) наличие в ииокулуме неинфекционных частиц; 3) необходимость присутствия двух или более типов частиц для осуществления заражения, что имеет место в случае многокомпонентных вирусов (гл. VIII).

Далее

По сравнению с передачей вирусов в полевых условиях с помощью-беспозвоночных или в результате вегетативного размножения передача механическим путем обычно играет мепынуго роль. Однако для некоторых вирусов этот способ передачи имеет большое практическое значение. Так, вирус табачной мозаики может распространяться на табачных плантациях и плантациях томатов, легко загрязняя инструменты, руки и одежду работающих там людей. Этот способ передачи вируса имеет особенно большое практическое значение на ранних этапах роста полевых культур, в частности при высаживании растений. Растения, инфицированные в ранний период роста, являются источником распространения вируса в дальнейшем, что происходит либо во время проведения необходимых для данной культуры мероприятий, например удаления почек, либо в результате соприкосновения больных и здоровых растений при ветре. Х-вирус картофеля также легко может передаваться, загрязняя орудия производства и обрабатывающие машины; передача осуществляется рабочими или животными, ранее контактировавшими с больными растениями [1776], причем в некоторых случаях вирус может сохраняться таким образом в течение нескольких недель.

Далее

При использовании механических, способов передачи с целью выявления присутствия вируса как возбудителя данного заболевания необходимо иметь в виду основные иричины, которые могут привести к появлению отрицательных результатов. Эти причины таковы: 1) присутствие ингибиторов в отжатом соке растений; 2) низкая концентрация вируса или слабо выраженная чувствительность растения-хозяина; 3) нестабильность вируса в экстрактах из листьев.

Далее

Обычно для исследований используются листовые пластинки. У большинства растений, применяемых в такого рода опытах, от 50 до 70% всей свежей массы приходится на долю листьев, причем конечная концентрация вируса в листе часто оказывается в 10—20 раз выше, чем в других частях растения. Различают четыре типа систем, используемых для исследования: 1) интактиые растения, 2) переживающие ткани, 3) клетки или органы в культуре и 4) бесклеточные системы. Преимущества и трудности работы с каждой из этих систем обсуждаются ниже. Некоторые вирусы растений реплицируются в организме насекомых, которые являются их переносчиками. Этот вопрос обсуждается в гл. XVI.

Далее

Метод отделенных листьев удобен в тех случаях, когда для экспериментов требуется большое количество листовой ткани. Черешки листьев можно поместить в воду или в питательный раствор. Правда, в этих условиях листья ■обычно довольно сильно различаются по количеству поглощаемой ими жидкости. Кроме того, они могут неожиданно оказаться увядшими. С другой стороны, этот метод сводит к минимуму такую проблему, как рост микроорганизмов в ткани во время инкубации. Чаще листья помещают во влажную камеру, закрытую стеклом. Инокулировашше и пеииокулиропашше половинки листьев можно инкубировать раздельно [748]. При этом приходится считаться ■с возможностью роста бактерий, грибов и простейших. Было, например, показано, что стерильные и нестерильные листья редиса различаются по интен-сивности включения : аР-ортофосфата в нуклеиновые кислоты [301].

Далее

Растительные клетки можно выращивать в культуре несколькими способами: выращивают либо целые органы (например, корни или верхушки стеблей), либо ткань каллюса, либо, наконец, клеточные суспензии. Все эти способы были испробованы при изучении репликации вирусов, однако результаты оказались неутешительными (если не считать некоторых микроскопических исследований). Количество вируса, продуцируемого в культуре ткани, обычно намного ниже, чем в интактных зеленых листьях.

Далее

В листьях многих растений запас низкомолекулярпых фосфорсодержащих соединений довольно велик. С помощью различных манипуляций можно несколько понизить или повысить общую концентрацию фосфорсодержащих компонентов, однако не более чем в 2—3 раза. Поэтому с листовой тканыо и радиоактивным фосфором не удается проводить достаточно эффективные опыты с вытеснением метки. Показано, однако, что у водного растения БрггойеЫ в условиях недостатка фосфора пул резервного неорганического фосфата, локализующийся в вакуоли, сильно истощается, а содержание метаболически активных фосфорсодержащих компонентов остается неизменным [198]. Подбирая соответствующие способы снабжения таких растений фосфором и комбинируя их с современными методами выделения и фракционирования фосфорсодержащих соединений, можно добиться большего эффекта от применения радиоактивных изотопов при изучении репликации вирусов [197].

Далее

До самого последнего времени считалось неразумным проводить аналогии между вирусами, поражающими различные крупные группы организмов. Однако достижения молекулярной биологии продемонстрировали единство основных механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белка в природе. Поэтому, прежде чем анализировать довольно скудцыо экспериментальные данные о размножении вирусов растений, мы кратко рассмотрим основные особенности репликации некоторых РНК-содержащих бактериофагов и вирусов животных. Даже в отношении этих вирусов детали процесса репликации изучены еще далеко не достаточно.

Далее

Таким образом, хотя и несомненно, что РЫК большинства фитопатоген-1шх вирусов содержит значительно больше информации, чем требуется для кодирования белка оболочки, число и характер дополнительных кодируемых функций остается невыясненным.

Далее

Структура палочкообразных ж мелких сферичоских вирусов растений свидетельствует о том, что для сборки полных вируелтих частиц не требуется дополнительной информации, если синтезированы РНК и белковые субъединицы. Механизм, определяющий взаимодействие белковых субъединиц при формировании сферической оболочки или пустой палочкообразной частицы, зависит исключительно от пространственных свойств структурной субъединицы. Эти свойства определяются аминокислотной последовательностью белка, которая в свою очоредъ определяется вирусной РНК. Описанные ниже опыты по реконструкции вирусов в основном подтверждают ату точку зрения.

Далее

Подобные отличия были найдены также при сравнении вируса некроза табака и выделенной из него РНК (опыта проводились на фасоли и на N. glutinosa). Если инокулумом служила РНК, то устойчивость инфекционных центров начинала расти непосредственно после инокуляции; если жо использовался интактиый вирус, то росту устойчивости предшествовал лаг-период, продолжавшийся 2—4 ч [934]. При этом было отмечено, что самые первые некрозы, вызываемые как РНК, так и интактным вирусом, появляются одновременно, однако некрозы, вызываемые свободной РНК, достигают максимального числа и нормального вида раньше, чем те, которые возникают при инокуляции интактным вирусом. Различие во времени появления максимума некрозов достигало 4 ч (фиг. 23).

Далее

Рядом авторов исследовалась возможность участия ДНК клетки-хозяина в размножении вирусов растений. Выло найдено, что ДНК, выделенная из здоровых листьев табака и из листьев, зараженных ВТМ, имеет один и тот же нуклеотидный состав и включает 32Р с одинаковой скоростью [1416]. Затем были получены более существенные доказательства того, что участие-в синтезе РНК ВТМ не является прямой функцией ДНК хозяина [14701. Здоровые и инфицированные листья табака обрабатывались актииомищгаом Б (антибиотиком, который при соответствующих условиях специфически блокирует ДНК-зависимый синтез РНК). При этом синтез РНК вируса табачной мозаики продолжался на несколько пониженном уровне, тогда как синтез клеточных РНК был по существу блокирован.

Далее

Растения снабжались через корни ,гР-ортофосфатом в точение 60 мин. А. Необработанная нуклеиновая кислота. В. Нуклеиновая кислота, обработанная РНКазой. I — оптическая плотность при 280 нм; II — радиоактивность. Пик радиоактивности при 0,03 М соответствует двухцепочечной вирусной РНК.

Далее

Согласно распространенным представлениям о репликации мелких РНК-содержащих вирусов бактерий и животных, проникшая в клетку свободная вирусная РНК присоединяется к рибосоме (или рибосомам) и действует как матрица для синтеза вирусной РНК-полимеразы, поело чего образовавшаяся вирусная РНК-полимераза катализирует синтез одной или нескольких комплементарных антипараллельных цепей на матрице родительской РНК. Однако до сих пор не удалось продемонстрировать присоединение родительской вирусной РНК к рибосомам. Правда, было показано, что небольшая часть родительской РНК ВЖМТ, меченной заР, становилась устойчивой к рибонуклеазе вскоре после заражения [1041]. Количество такой РНК достигало максимума через 20 мин и затем очень быстро падало. Этот результат очень хорошо согласовывался с предположением о том, что на родительской цепи синтезируется комплементарная ей минус-цепь, после чего родительская РНК вытесняется из образовавшейся двухценочечной структуры новосинтезированной дочерней вирусной РНК. Однако уровень радиоактивности в этих опытах был очень низок, и устойчивая к рибонуклеазе радиоактивность не была никак охарактеризована. Более того, кажется вообще маловероятным, чтобы все процессы в инфицированных клетках происходили бы так четко «в фазе», как можно предполагать па основании этих опытов.

Далее

На основании универсальности генетического кода исследователи часто склонны считать, что транспортная РНК из одного организма способна функционировать без ошибок в белоксинтезирующей системе из другого организма. Однако результаты недавних экспериментов показывают, что это не так [174]. Исследовался вопрос о том, насколько эффективно и точно четыре дрожжевые глициновые тРНК, предварительно нагруженные глицином, включают глицин в структурный белок фага R17, используя при этом в качестве матрицы РНК фага R17 в бесклеточиой системе из E. coli (бактериальные глициновые тРНК были из этой системы почти полностью удалены). Среди трех исследованных пептидов структурного белка, синтезированных в системе, присутствовал пептид-2, в который дрожжевые глициновые тРНК включали дополнительный глицин (вероятно, на место, где в норме присутствует какая-то другая аминокислота). Таким образом, некоторые трудности, возникающие при попытке продемонстрировать синтез структурного белка фитопатогенных вирусов в белоксинтезирующей бесклеточной системе, можно, очевидно, объяснить именно подобными ошибками, связанными с применением гетерологичных систем.

Далее

Результаты работ ряда авторов наводят на мысль о том, что в первые деш.-два после заражения ВТМ накапливается некоторое количество свободной вирусной РНК. Так, было показано, что фенольные экстракты, полученные через 20—40 ч после заражения растений, обладали большей инфек-ционностыо, чем можно было ожидать, исходя из того количества интакт-пого вируса, которое в них присутствовало [492]. Отметим, однако, что примененный в этой работе метод определения инфекционности вызывает некоторое сомнение.

Далее

Чтобы проследить за распространением вируса из первично инфицированных клеток, с зараженных листьев N. sylvestris удаляли эпидермис через различные промежутки времени после заражения и выявляли вирус в лежащем под ним мезофилле с помощью другого растения-хозяина [1801 I. Было найдено, что при 24—30 °С вирус проникает в клетки мезофилла через 4 ч после заражехтия. Снятие эпидермиса с листьев растений коровьего гороха, аараженпых вирусом огуречной мозаики (при 28 °С), по предотвращало последующего появления некрозов в лежащем под ним мезофилле, если эта процедура выполнялась через 2 ч после заражения. 1!о-видимом.у, к этому времени инфекционный материал перемещался из эпидермиса в мезофилл. Время, необходимое для инфицирования мезофилла, увеличивалось по мере снижения температуры [1892].

Далее

При оценке типа кривой роста вируса нужно иметь в виду, что различное и пе известное нам количество вируса может оставаться связанным с нерастворимым остатком в анализируемых экстрактах. Этот фактор, вероятно, не слитком важен, если вирус присутствует в цитоплазме в высокой концентрации, но он может иметь серьезное значение для тех вирусов, концентрация которых невелика, а также для вирусов, связанных с какими-либо клеточными оргаиеллами или клеточными включениями.

Далее

При попытках определить место сборки вируса в клетке использовались два основных подхода: 1) фракционирование клеточных компонентов из тканевых экстрактов с последующим выявлением вируса в различных фракциях и 2) световая и электронная микроскопия.

Далее

Скорость движения от клетки к клетке измерялась несколькими способами. Радиус местных некрозов, вызываемых ВТМ у N. glutinosa, увеличивается линейно в зависимости от времени [1392]. Для каждого из трех изученных штаммов вируса характерна определенная скорость этого увеличения (в пределах от 1 до 6 мкм в час; фиг. 32).

Далее

Поскольку болезни растений, важные с экономической точки зрения, обычно связаны с системной инфекцией, наибольшее внимание принято уделять тем вирусам, которые способны перемещаться из места внедрения и поражать различные части растения. Весьма немногие вирусы ограничиваются проникновением только в листовую пароихиму. Это те вирусы, которые распространяются путем медленного перемещения от клетки к клетке (вероятно, по плазмодесмам). Возможно, таким путем перемещаются упомянутые выше дефектные вирусы, существующие в форме «голой» РНК. Однако большинство вирусов обладает способностью довольно быстро передвигаться по проводящим тканям.

Далее

ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСА.Считается, что вирусы, вызывающие системную инфекцию, распределяются по растению достаточно равномерно. Однако это вряд ли соответствует действительности. Имеется ряд факторов, которые обычно обусловливают очень неравномерное распределение.

Далее

Известии, однако, многие примеры возникновения ограниченной, местной инфекции без гибели клеток. Ограничение распространения инфекции может быть сложным явлением, зависящим от развития устойчивости к вирусу в окружающей ткани (гл. XII).

Далее

Как уже говорилось в разд. «Движение вирусов по растению», количество некоторых вирусов первоначально быстро увеличивается в зараженных листьях, а затем снижается. Это может обусловливать очень неравномерное распределение вируса в различных листьях в каждый данный момент. На фиг. 34 показано, как изменяется распределение Л-вируса картофеля в листьях растений табака па протяжении 14 недельпого периода.

Далее

При системной инфекции, длящейся в течение какого-то периода времени, концентрация вируса в разных органах растения может быть неодинаковой. У большинства вирусов, вызывающих мозаику, максимальная концентрация отмечается в листовой пластинке. В случае ВЖМТ, например, концентрация вируса в стебле, корневой системе, средней жилке и черешках уже развернувшихся листьев в 10—20 раз ниже ого концентрации в листовых пластипках.

Далее

Такое неравномерное распределение вируса при мозаичных заболеваниях наблюдается иногда и в лепестках пораженных цветков. Известно, например, что ВТМ вызывает образование белых секторов на розовых цветках табака; вирус при этом, очевидно, сосредоточивается в белых участках лепестков.

Далее

Однако для многих комбинаций вирус — хозяин установлено, что вблизи верхушки побега и у кончика корпя существует зона большего или меньшего размера, совсем не содержащая вируса или содержащая очень малое его количество. Это обстоятельство используется для получения свободных от вируса клонов клеток (их получают, выращивая изолированные верхушки побегов в культуре ткапи; гл. XVIII).

Далее

Частицы двух основных классов удается разделить путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. По своим антигенным свойствам все они очень сходны или даже идентичны [725]. Инфекционны только длинные частицы. Длинные частицы можно разрушить in vitro щелочыо, мочевиной или детергентом, однако при этом, по-видимому, не происходит преимущественного образования фракции коротких частиц, идентичных по длине обычным коротким частицам этого вируса [1537].

Далее

Джонсон [892] фракционировал в равновесном градиенте плотности хлористого цезия специально приготовленный препарат ВЖМТ с низким содержанием ионов металлов. Он обнаружил три минорных компонента, плавучая плотность которых была ниже, чем плотность вируса, и один компонент с более высокой плотностью, по-видимому, соответствующий описанным выше минорным компонентам.

Далее

Это группа мелких сферических вирусов, более или менее отдаленных серологически и передающихся жуками. Сюда входят вирус мозаики тыквы, вирус крапчатости бобов фасоли и вирус мозаики коровьего гороха; каждый из этих вирусов можно разделить на несколько компонентов с различными коэффициентами седиментации.

Далее

Это сферический вирус, частицы которого имеют диаметр около 33 нм. В градиенте плотности сахарозы очищенные препараты этого вируса образуют две фракции, из которых только одна обладает инфекционностьго [590].

Далее

Б настоящее время ясно, что наличие в очищенных вирусных препаратах частиц более чем одного типа является не исключением, а правилом.Хотя морфологически различные классы частиц, продуцируемые разными вирусами, кажутся сходными, они могут различаться по происхождению и функциям. Здесь еще очень многое остается выяснить, однако на основании всего того, что нам уже известно о палочкообразных и икосаэдриче-ских вирусах, можно, по-видимому, сделать вывод о существовании трех ■основных типов взаимосвязи между различными классами частиц.

Далее

Вирусы-сателлиты, связанные с вирусом некроза табака, по-видимому, представляют крайнюю форму паразитизма. Система ВС — ВИТ отличается от двухкомпонентных вирусов в нескольких отношениях. Структурный белок ВС, вероятно, не родствен белку ВНТ; в то же время ВНТ является автономным вирусом, независимым от ВС.

Далее

В настоящем разделе суммированы данные относительно основных типов симптомов, возникающих при системной вирусной инфекции. Необходимо иметь в виду, что при определенных заболеваниях эти различные симптомы часто сопутствуют друг другу и что в ряде других случаев развитие заболевания сопровождается последовательной сменой симптомов различного типа.

Далее

Макроскопически выраженные симптомы вирусного заболевания отражают гистологические изменения, происходящие в инфицированном растении. Различают три основных типа таких аномальностей: 1) некротизация, или отмирание клеток и тканей; 2) гиперплазия, или избыточный рост и дифференциация; 3) гипоплазия, или подавление роста и дифференциации.

Далее

Вирусная инфекция часто приводит к изменению размеров и числа крахмальных зерен, которые можно наблюдать в клетках листа. При мозаичных заболеваниях эти клетки содержат обычно меньше крахмала, чем в норме, ■однако в некоторых других случаях (например, при курчавости верхушек •сахарной свеклы, скручивании листьев картофеля) крахмал может накапливаться в избыточных количествах.

Далее

В клетках, инфицированных ВТМ, с помощью светового и электронного микроскопов обнаружены различные типы включений.Такого рода включения наиболее часто встречаются в эпидермальных клетках и в клетках волосков. В листьях табака, обнаруживающих типичные мозаичные симптомы, кристаллические включения обнаруживаются почти во всех волосках и в опидермалышх клетках, расположенных в желто-зеленых участках листьев, тогда как клетки в темно-зеленых участках вообщо не содержат включений. Граница между желто-зелепыми и темно-зелеными участками может , быть достаточно четкой, так что существует зона, в которой соседние волоски листа либо совсем не содержат кристаллических включений, либо содержат их почти в каждой клетке (фото 25).

Далее

Исследуя серийные срезы инфицированных клеток, Эдвардсон [481], а также и Пурцифал и Эдвардсон [1369] показали, что пучки, цилиндры, трубочки и мельчайшие колесики, видимые на срезах, представляют собой части геометрически сложных включений. Эдвардсон [481] схематически воспроизвел структуру включений этого типа, образующихся при инфицировании клеток растений табака вирусом гравировки табака (фото 53).

Далее

Внутриядерные включения обнаружены также в случае заражения другим вирусом из группы У-вируса картофеля — вирусом желтой мозаики фасоли. Мюллер и Кёниг [1241] использовали размер включений в качестве индикатора инфекции определенным вирусом в тесте перекрестной инокуляции со штаммами вируса желтой мозаики. Один из этих штаммов продуцировал небольшое число очень крупных кристаллов в инфицированных клетках, другие — агрегаты мелких кристаллов. В опытах по перекрестной инокуляции растения, инфицированные штаммами, вызывающими образование’ мелких кристаллов, инокулировали штаммом, продуцирующим крупные кристаллы; о результатах теста судили по тому, присутствуют ли крупные кристаллы в ядрах клеток листа или нет. Вайнтрауб и Рагетли [1885] нашли, что кристаллические включения, индуцируемые вирусом желтой мозаики-фасоли, часто обнаруживаются в ядрышках зараженных клеток Vicia faba.

Далее

В ужо развернувшихся листьях, которые оказались полностью зараженными, но не обнаруживали симптомов мозаичности, влияние вируса на хло-ропласты было аналогичным его действию на инокулированные листья. На срезах листьев, находившихся в момент заражения в очень молодом возрасте, на которых развивалось типичное мозаичное заболевание, с помощью-светового микроскопа легко можно обнаружить ряд патологических отклонений в структуре хлоронластов. Островки ткани в мозаичных участках, имеющие различные оттенки зеленого, желтого и белого цветов, содержали, различные штаммы ВЖМТ, действующие на хлоропласта каждый своим особым и характерным образом (фото 37, цветная вклейка 1 и фото 56).

Далее

У растений, инфицированных другими мелкими сферическим вирусами, четко выраженных патологических изменений хлоропластов, сопутствующих ■инфекции ВЖМТ, по-видимому, не наблюдается. С помощью электронной микроскопии на тонких срезах клеток, инфицированных вирусом некроза табака или вирусом южной мозаики фасоли, обнаружены многочисленные вирусоподобные частицы и агрегаты регулярно расположенных частиц « цитоплазме 1483]. Частицы в агрегатах располагаются па таком же расстоянии друг от друга, как и в осадке очищенного вируса (что показано исследованием ультратонких срезов через преципитат вируса in vitro).

Далее

На ультратонких срезах листьев растений пшеницы, инфицированных вирусом полосатой мозаики пшеницы, в паренхимных клетках наблюдались включения, состоящие из вирусных частиц бацилловидной формы [1059, 1061]. В некоторых включениях частицы были расположены регулярным образом, а некоторые включения были окружены мембранами. Часто можно-было наблюдать группы частиц, тесно связанные с мембраной ядра, ограничивающей его снаружи, тогда как другие находились внутри ядра. Для некоторых внутриядерных включений были характерны мембраны, а другие не имели их.

Далее

В некоторых случаях (например, при заражении табака ВТМ) заболевание отдельного растения вызывается, по-видимому, в значительной степени каким-то одним штаммом вируса. Тем не менее уже много лет известно, что иногда светло-желтые участки мозаичного листа содержат различные штаммхи вируса.

Далее

Появление патологических симптомов, сходных с теми, которые вызываются вирусами, может быть обусловлено воздействием на растения ряда физических, химических и биологических агентов. Иногда легко сделать ошибочное заключение об участии вируса в возникновении болезни в полевых условиях. Так, например, результаты исследований, опубликованных недавно, содержат веские доводы в пользу того, что целая группа болезней, возникновение которых раньше приписывалось вирусной инфекции, в действительности вызываются организмами типа микоплазм.

Далее

Генетические аномалии могут имитировать и другие симптомы вирусных заболеваний. Например, Эдвардсои и Корбетт [482] описали «проволочный» мутант томатов сорта Марглоб, имеющий внешнее сходство с растениями, зараженными некоторыми штаммами вируса огуречной мозаики я ВТМ. Главная особенность этого мутанта — сильная редукция всех листовых пластинок, что придает растению своеобразный вид (фото 66).

Далее

Выращивание растений при температурах, значительно превышающих нормальную, может приводить к появлению симптомов, подобных том, которые возникают при вирусных болезнях. Если растения N. glutinom выдерживать при температуре 37,8 °С в течение 4—8 дней, а затем вновь перенести в помещение с температурой 22 °С, то на новых листьях появляется мозаичпый рисунок, отмечается посветление жилок, хлороз и другие аномалии, напоминающие картину, характерную для вирусной инфекции (фото 67). Эти симптомы постепенно исчезают на вновь образующихся листьях, но могут возникнуть на этом же растении снова при повторном воздействии высокой температуры [880]. С помощью методов механической инокуляции и прививок различным хозяевам и метода электронной микроскопии в прогретых растениях не удалось выявить вируса.

Далее

Выпускаемые в продажу препараты гормонов, используемые в качестве гербицидов, могут вызывать у некоторых растений симптомы, подобные симптомам тех или иных вирусных инфекций. Томаты и виноград особенно чувствительны к действию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Нарушения роста, проявляющиеся под влиянием 2,4-Д, несколько напоминают симптомы вирусных инфекций, проявляющиеся у этих и других растений-хозяев (фото 68). Соединения, родственные 2,4-Д, могут приводить к почти полному угнетению развития мезофилла. В других случаях, наоборот, рост жилок задерживается в большей степени, чем рост мезофилла. В этих случаях мезофилл может выпячиваться между жилками, придавая листьям вид, сходный с симптомом курчавости листьев (например, у табака и хлопчатника) [48].

Далее

Было показано, что при введении актиномицина Б в нижний лист молодых растений табака на молодых распускающихся листьях приблизительно через день после введения антибиотика можно отметить посветленио жилок [781]. На распустившихся молодых листьях возникают мозаичные рисунки, очень сходные с теми, которые характерны для инфекции обычным штаммом ВТМ. В листьях, появляющихся позднее, симптомы, вызванные действием антибиотика, оказывались выраженными слабее, а затем образовывались и вовсе нормальные листья. Объяснить это явление в настоящее время невозможно, но, вероятно, актииомицип Б в момент проникновения в молодой лист повреждает некоторые клетки, причем продолжает действовать на протяжении последующих клеточных делений, вызывая образование островков пожелтевшей ткани; в то же время другие клетки остаются неповрежденными (если иметь в виду состояние хлоропластов).

Далее

Для изучения влияния вирусов на организм растения-хозяина применяют в основном те же экспериментальные системы, которые описаны в гл. VII. Хотя крайне желательна была бы разработка эффективной системы с использованием культуры ткани для изучения репликации вирусов и для исследования некоторых сторон метаболизма зараженных клеток, избежать работы с интактными растениями и органами совершенно невозможно, если иметь целью когда-нибудь понять процессы, связанные с болезнью. При использовании интактных растений или органов следует принимать во внимание множество параметров. Все, что сказано ниже, касается главным образом изменений, происходящих в листьях, поскольку они составляют основную массу большинства травянистых растений. Большинство вирусов обычно развивается в листьях, которые чаще всего и используются в разного рода экспериментах.

Далее

К величинам, которые могут служить основой для выражения результатов, относятся сырая и сухая масса ткани, содержание белкового азота, содержание ДНК, площадь листа; результаты выражаются в расчете на растение, на лист или на клетку. Данные о сырой массе получить легче всего, и соответствующие измерения издавна проводились наиболее широко. Этот метод является удовлетворительным, когда нужно обнаружить сильно выраженные различия на самых ранних стадиях после заражения. Однако в результате вирусной инфекции содержание воды в тканях вскоре после заражения может нарушаться. В болое поздние сроки возможно прекращение роста, что обусловливает серьезные трудности с использованием этого параметра. В зараженных вирусом листьях концентрация многих компонентов на единицу сирой массы может оказаться выше из-за того, что листья у таких растений имеют меньшие размеры, чем здоровые листья того же возраста. В то же время если сравнивать листья одинакового размера, то концентрация этих компонентов на единицу сырой массы в зараженных листьях может оказаться ниже, чем в здоровых. Аналогичные осложнения возникают также при измерениях сухой массы. Сам вирус может составлять около 10% сухой массы листа. В результате остановки роста доля инертных компонентов клеточной оболочки возрастает, а за счет накопления крахмала, вызванного вирусной инфекцией, может увеличиться сухая масса. Содержание белкового азота также может значительно изменяться в связи с присутствием вируса и с общей остановкой роста.

Далее

У большинства травянистых растений, используемых п вирусологических экспериментах, отдельные листья никогда не находятся в стационарном состоянии. Они обычно проходят через четыре стадии, плавно переходящие одна в другую. Первая стадия, в ходе которой лист табака, например, достигает около 2 см в длину, — это стадия интенсивного клеточного деления. Ее сменяет стадия, иа которой рост (растяжение) клеток и синтез белка становятся преобладающими. По мере того как лист приближается к своим окончательным размерам, самым активным процессом становится фотосинтез (он продолжается с самой ранней стадии), и, наконец, на четвертой стадии берут верх процессы старения. В качестве иллюстрации непрерывных изменений в растущем листе на фиг. 42 приведены изменения содержания рибосом в листьях китайской капусты.

Далее

Между двумя первичными листьями различия минимальны, поэтому такие листья служат полезным экспериментальным материалом у таких растений, как Phaseolus vulgaris. Кроме первичных листьев, нет двух других таких листьев среди множества листьев растений, используемых для изучения вирусов, которые находились бы па одной и той же стадии развития. Эту трудность можно до некоторой степени преодолеть, если работать с группами растений, отбирая для изучения по одному листу данного размера. Даже в этом случае очень немногие листья в группе будут находиться абсолютно па одной и той же стадии развития, так как образование листьев у разных растений происходит неодновременно. При работе с такими быстро растущими растениями, как китайская капуста, у которых молодые листья могут удваиваться в размере за 30—40 ч, группа растений для отбора (с целью получения достаточно однородного набора молодых листьев) должна быть болое многочисленной.

Далее

Появление в клетках особого вида РНК (двухцепочечной вирусной РНК), возможное накопление свободной вирусной РНК и образование вирусного белка в процессе инфекции обсуждались в гл. VII. Здесь мы рассмотрим вопросы, касающиеся влияния вирусной инфекции на синтез нуклеиновых кислот и белка клетки-хозяина.

Далее

Исследования, посвященные изучению возможного влияния вирусной инфекции на ДНК растения-хозяина, очень немногочисленны. Портер и Вайнштейн [1347] не обнаружили значительных различий в содержании ДНК (в расчете на одно растение) между здоровыми и зараженными вирусом огуречной мозаики растениями табака в течение первых 280 ч после заражения. В то же время в листьях Prunus mahaleb, дважды зараженных определенными вирусами, содержание ДНК на единицу сухой массы через несколько месяцев после заражения (когда симптомы болезни в листьях исчезли) было снижено примерно па 20% [828]. Отмечалось также снижение содержания РНК, однако за неимением других данных нельзя решить, в чем на самом деле проявляется действие вируса — в снижении содержания нуклеиновых кислот или же в увеличении сухой массы по сравнению со здоровыми растениями.

Далее

Эксперименты другого рода позволяют предположить, что количество РНК в клетках растения-хозяина может значительно возрастать вскоре после заражения ВТМ, однако какая именно фракция РНК синтезируется с повышенной интенсивностью, пока неизвестно (см., например, [1443]).

Далее

Определяли активность некоторых ферментов в нормальной ж в зараженной вирусом ткали. При атом обычно принималось, что обнаруживаемые различия отражают изменения в содержании фермента, происходящие под влиянием вирусной инфекции, и обращали недостаточно внимания на другую возможность — изменение активности ферментов в результате высвобождения ингибиторов или активаторов фермента при разрушении клеток. Кроме того, часто не учитывались трудности, связанные с выбором адекватного способа выражения активности фермента. Многие исследования были выполнены до того, как было установлено широкое распространение изоферментов. Некоторые из опубликованных данных приведены в табл. И.

Далее

Специалисты в области биохимии растений обычно проявляют весьма слабый интерес к метаболизму липидов. О влиянии вирусной инфекции на липиды известно гораздо меньше, чем о других биохимических изменениях в зараженных вирусами растениях. Согласно цитологическим данным, полученным в последнее время, в клетках, зараженных вирусами, обычно наблюдаются изменения мембранных структур. Кроме того, эти данные свидетельствуют о возможной связи мембран со сборкой некоторых вирусов. Таким образом, весьма полезным было бы биохимическое исследование влияния вирусной инфекции на липиды и липопротеиды в клетках и изолированных клеточных оргапеллах, особенно в сочетании с соответствующими цитологическими исследованиями.

Далее

Некоторые вирусы незначительно влияют на углеводы в листьях, тогда как другие могут нарушать как скорость их синтеза, так и скорость перемещения по растению. Если листья через несколько дней после заражения вирусом, не вызывающим образования местных некрозов, собрать (утром или после пребывания в течение нескольких часов в темноте), обесцветить и обработать иодом, то локальные повреждения могут проявиться в виде темных участков, контрастирующих с бледным фоном. Это наблюдение говорит о том, что крахмал не исчезает только в участках хлорепхимьт, инфицированной вирусом. Таким образом, эта задержка не зависит от изменений в проводящих тканях. Каково значение изменений клеточной проницаемости и активности ферментов в этом процессе, неизвестно.

Далее

Влияние вирусной инфекции на компоненты клеточной оболочки мало исследовано. У N. glutinosa, зараженных ВТМ, в оболочках клеток, окружающих некротические участки на листьях (в радиусе примерно 50 клеток), в срединной пластинке содержится пектат кальция. В то же время в клетках здоровой ткани срединная пластинка содержит в основном пектиновую кислоту. В этой зоне клеток активный вирус ие был обнаружен [1884].

Далее

Общее содержание фосфора в здоровых и в зараженных ВТМ или Х-ви-русом картофеля листьях табака весьма сходно, однако относительное содержание фосфора нуклеиновых кислот временно возрастает во время наиболее интенсивного синтеза вируса [488].

Далее

А. Здоровые листья. Б. Заражение «бледно-зеленым» штаммом. В. Заражение «желто-зеленым штаммом. Г. Заражение «белым» штаммом.Вероятно, накопление большинства ароматических соединений является не специфическим эффектом, связанным с гибелью клеток независимо от вызвавших ее причин — заражения вирусами, грибами или действия других агентов.

Далее

Уменьшение содержания пигментов в листьях может быть обусловлено либо подавлением развития хлоропластов, либо разрушением пигментов в зрелых хлоропластах. Первый процесс, вероятно, преобладает в молодых листьях, развивающихся но мере развития инфекции. Хлороз, часто наблюдаемый вблизи местных некрозов при инокуляции зрелых зеленых листьев, должно быть, обусловлен разрушением ужо имевшихся в них пигментов. Некоторые штаммы ВЖМТ вызывают хлоротические местные поражения, не сопровождающиеся структурной деградацией гран, тогда как «белые» штаммы вызывают дегенерацию граи в зрелых хлоропластах (фиг. 44).

Далее

При заражении ВТМ в листьях томатов, выращенных на очень плодородной суглинистой почве, отмечалось значительное уменьшение (до 50%) содержания марганца, меди и цинка (в процентах от сухой массы). В то же-время инфекция совсем или почти совсем не влияла па процентное содержание калия, кальция, магния, железа, бора и алюминия [173].

Далее

Подавление или стимуляция роста, вероятно, наиболее характерные -симптомы вирусных болезней растений. Многих исследователей привлекала идея, согласно которой вирусы каким-то образом изменяют действие гормонов, тем самым влияя на ход развития болезни. Сравнительно недавно был сделан значительный шаг вперед в изучении природных соединений, которые являются стимуляторами и ингибиторами роста или служат факторами ■органогенеза. Сейчас известны три типа стимуляторов роста: ауксины, цитокинины и гиббереллиньг. Представители каждой из этих групп были изучены химически и биологически на изолированных тканях или органах в условиях контролируемого роста. В интактном растеиии, однако, действие этих веществ на рост и физиологическую активность может быть самым различным [1063]. Их функции до некоторой степени перекрываются, а взаимодействия оказываются весьма сложными. Влияние этих веществ на тот или иной процесс может быть сходным, синергичным или антагонистическим. Помимо действия в интактпых растениях, цитокинины влияют на ряд физиологических процессов в изолированных листьях. Они задерживают староние листьев, продлевают синтез белка и РНК, регулируют транспорт питательных веществ и повышают устойчивость изолированных листьев к высокой температуре. Гиббереллины оказывают в некоторых случаях сходное действие.

Далее

Было показано, что обычно в инфицированных листьях через несколько-дней после заражения фотосиптетичсская активность снижается [871, 1303, 1305, 1430, 1799, 1800]. Спайке и Стаут [1649] исследовали реакцию Хилла в изолированных хлоропластах сахарной свеклы, зараженной вирусом желтухи, в широком диапазоне освещенности, почти до 14 000 эрг/(см2-с). Как световая, так и темновая реакции бьтли подавлены почти на 50% (в расчете на постоянное количество хлорофилла).

Далее

Большинство исследований, посвященных изучению влияния вирусной инфекции на дыхание, ограничивается измерением скоростей потребления кислорода или выделения С02. Эксперименты обычно проводились на растениях с системным заражением, и результаты выражались самыми различными способами. До недавнего времени насчитывается немного серьезных исследований, касающихся возможных механизмов нарушения процессов ■образования энергии в растениях под влиянием вирусной инфекции.

Далее

На основании данных весьма немногочисленных исследований можно-предположить, что скорость транспирации и содержание воды у больных растении ниже, чем у здоровых (по крайней мере в момент иаивысшего развития инфекции) [657, 1295, 1306, 1312].

Далее

Нет основания предполагать, что основные нарушения метаболизма растения-хозяина обязательно определяются узловыми процессами, непосредственно связанными с репликацией вирусов. Какое-то незначительное первоначальное воздействие, обусловленное внедрением вируса и его репликацией, может привести к глубоким вторичным изменениям в клетке-хозяние. Такие изменения могут завуалировать важные первичные воздействия даже на очень ранней стадии после заражения.

Далее

Генетическая природа растения-хозяина часто оказывает глубокое влияние па результат заражения растения определенным вирусом. Мы рассмотрим несколько типов реакции растения па заражение: а) иммунность — растения не заражаются ни при каких условиях; б) устойчивость к заражению; в) сверхчувствительность — в месте инокуляции развиваются некротические поражения, причем в другие участки листа вирус не распространяется; г) толерантность — вирус размножается и распространяется по тканям растения, но симптомы заболевания выражены слабо. Кроме того, важное значение для распространения вируса в полевых условиях могцет иметь наследственная устойчивость растения-хозяина к насекомому-переиосчику гл. XVI).

Далее

Условия среды, в которых растения выращивались до инокуляции, условия, в которых производилась инокуляция, и условия, в которых развивалось заболевание, могут оказывать четко выраженное действие на течение инфекции. Растоние, обладающее высокой восприимчивостью к данному вирусу при одних условиях, может оказаться полностью устойчивым в других условиях. В ходе инфекции в зависимости от условий окружающей среды концентрация вируса может быть высокой или низкой, симптомы заболевания бывают выражены очень отчетливо или маскируются.

Далее

На восприимчивость растений к заражению вирусом оказывают влияние изменения освещенности двух типов, а именно: 1) кратковременные изменения интенсивности света (отклонения от нормальных условий на период не более 1 или 2 дней) и 2) изменения освещенности на протяжении длительных периодов, влияющие на рост растения.

Далее

Влияние интенсивности и продолжительности освещения иа размножение вируса и степень проявления заболевания может быть различным для разных вирусов, однако обычно высокая интенсивность света и длинный ■световой день благоприятствуют размножению [72, 1354, 1355, 1733].

Далее

Для большинства вирусов характерна высокая частота мутаций, приводящих к возникновению новых штаммов. Присутствие мутантных штаммов может оказывать заметное влияние на проявление симптомов заболевания (гл. IX). Скорость размножения вируса в том или ином растеции-хозяиие и характер развивающегося при этом заболевания иногда довольно сильно-зависят от присутствия другого, неродственного вируса или каких-либо-клеточных паразитов.

Далее

Хорошо известно, что два неродственных вируса могут одновременно заражать одно и то же растение, однако детальных исследований относительно влияния одного вируса на концентрацию другого проводилось мало. Как показывают полученные данные, некоторые вирусы взаимно антагонистичны, тогда как в некоторых других сочетаниях один из вирусов при смешанном заражении достигает больших концентраций, чем в случаях, когда растение заражено им одним. Степень антагонизма или синергизма в значительной степени зависит от последовательности заражения растения разными вирусами. Боудэн и Кассанис [102] показали, что заражение растений табака вирусом суровой гравировки предотвращает размножение в них У-вируса картофеля или вируса 3 растений белены. В том случае, если растения инокулировали одновременно двумя вирусами, вирус гравировки табака подавлял развитие вируса-партнера.

Далее

На основании полевых наблюдений был сделан вывод о том, что заболевание, вызываемое грибом Phytophthora infestans, развивается медленнее, если растение заражено вирусами [1240]. Этот вывод был подтвержден лабораторными опытами el-и У-вирусами картофеля. Подавляющее действие вирусной инфекции на грибное заболевание тем больше, чем сильнее выражены симптомы вирусного заболевания; этот вывод сделай на основании опытов с различными штаммами вирусов и сортами картофеля. Аналогичные наблюдения были сделаны в полевых условиях [478].

Далее

Растения могут приобретать устойчивость к повторному заражению тем же самым вирусом или родственными ему штаммами двумя путями. В одном случае вирус может присутствовать в большинстве органов растения, и при этом растение оказывается устойчивым к инфекции родственными штаммами вируса. Это явление носит название «нестерильной приобретенной устойчивости» и обсуждается в гл. XIII. Для другого типа приобретенной устойчивости, обсуждаемого в настоящем разделе, характерно, что в то время, как одни участки растения инфицируются вирусом, другие участки, более или менее удаленные от тканей, содержащих вирус, приобретают устойчивость к заражению тем же вирусом, родственными; ему штаммами, а в ряде случаев — и к заражению неродственными вирусами. Это явление может быть названо «стерильной приобретенной устойчивостью».

Далее

Принимая во внимание приводимые ниже данные о частоте мутаций вирусов, следует признать маловероятным, чтобы та или иная вирусная культура могла содержать частащы только одного штамма. Даже в процессе развития одного местного некроза может возникнуть много мутантных частиц (хотя подавляющее большинство частиц обычно принадлежит к одному штамму). Разнообразные химические и физические анализы, описанные ниже, дают полезную информацию только потому, что современные методы не выявляют тех штаммов, которые присутствуют в вирусном препарате в небольшом количестве. Возникновение нового штамма устанавливается почти всегда по его биологическим свойствам, обычно по характерным симптомам заболевания у соответствующего растения-хозяина. Существует несколько способов получения новых штаммов вирусов.

Далее

В природе различные штаммы вируса часто возникают либо в определенных. видах или разновидностях растений-хозяев, либо в особых условиях. Возникшие новые штаммы можно поддерживать в определенных растепиях-хозяевах в теплице. Если мы располагаем соответствующим видом растений, то изолят вируса, полученный в полевых условиях, следует несколько раз пассировать через некроз. Цель этих пассажей состоит в том, чтобы по возможности убедиться в том, что перед пами один штамм и что полученный изолят свободен от примеси неродственных вирусов.

Далее

Известны растения, в которых преимущественно репродуцируются определенные штаммы вируса (см. ниже). Такое растение-хозяин может быть использовано для отбора некоторых штаммов. Различные вирусные штаммы могут отличаться но степени репродукции и скорости распространения в данном растении при различных температурах. Так, в целях получения штамма ВТМ, обладающего способностью к наиболее эффективной репродукции при 36 °С, Леберье и Хирт [1056] применили метод серийных пассажей вируса на растениях табака в условиях постепенного повышения температуры.

Далее

Другой метод выделения мутантов и определения частоты мутаций со-•стоит в инокуляции родительским штаммом вируса растений, которые реагируют системным заболеванием без некрозов или каких-либо других явных местных поражений. В этом случае можно выявить мутанты:, вызывающие некрозы, желтые пятна или другие характерные местные поражения в ипоку-лированном растении. Этот прием позволяет отбирать мутанты, принадлежащие к определенному классу, причем в ряде случаев бывает трудно даже •с помощью повторных пассажей материала, выделенного из отдельного местного поражения, получить изолят, свободный от примеси родительского штамма (фото 73).

Далее

Описаппне методы могут быть использованы для количественной оценки мутагенного действия на вирус того или иного агента. Можно, однако, возразить, сославшись па то, что различные штаммы, уже присутствующие в вирусных препаратах, обладают различной чувствительностью к инактивирующему действию исследуемого мутагенного агента; та или иная обработка может инактивировать родительский штамм в большей степени, чем споптаппые мутанты, уже присутствующие в препарате [97]. По крайней мере по отношению 1? мутантам, полученным с помощью азотистой кислоты, такое возражение высказывалось (см. ниже).

Далее

Недавно было обнаружено, что мутагенное действие на бактериальные-ДНК-вирусы оказывают лучи с длиной волны 320—400 нм (область, близкая к зоне видимого света), обладающие низкой интенсивностью [1023]. Возможное влияние радиации в этом диапазоне длин волн на вирусы растений пока не обнаружено.

Далее

Некоторые аналоги азотистых оснований могут включаться в вирусную РНК при обработке этими соединениями инфицированных растений (гл. XIV). Известно, что эти соединения вызывают увеличение частоты мутаций у бактерий и бактериальных вирусов. Установлено, что 5-фторурацил в значительных количествах включается в РНК ВТМ. Крамер и др. [1022] показали, что если в препарате вируса 36—56% урацила РНК замещено на 5-фторурацил, то частота мутаций в 5—10 раз превышает контрольную.

Далее

Мундри и Гирер показали, что присутствие структурного вирусного белка по влияет па частоту мутаций (которую определяли по числу местных некрозов иа растениях табака сорта Ява). В их опытах частота мутаций оказалась одинаковой для цельного вируса, вирусной РНК и РНК, выделенной иа дольного вируса, обработанного азотистой кислотой.

Далее

Диметилсульфат — один из нескольких исследованных Френкель-Кон-ратом [534] алкилирующих агентов, оказывающих мутагенное действие на ВТМ и РНК ВТМ. Тонкие детали механизма действия этого соединения не известны, однако показано, что в присутствии диметил сульфата многие остатки гуанина метилируются с образованием 7-метилгуанина.

Далее

Приблизительно у 2/3 исследованных мутантов, отобранных на основании различий в симптомах вызываемых ими болезней, не было аминокислотных замещений в структурном белке. Как полагают, мутанты этого-типа несут изменения в той части РНК, которая контролирует синтез неструктурных вирусоспецифичных белков, определяющих тип симптомов. Наибольшее число замещений аминокислот в структурном белке оказалось, равным двум для мутантов, индуцированных химическими соединениями, и трем — в одном из полученных в теплице спонтанных мутантов. В структурном белке некоторых других природных штаммов ВТМ обнаружено значительно большее число замещений.

Далее

Состав кодонов показывает, что каждое замещение аминокислоты связано с заменой одного основания в триплете (в соответствии с правилами, установленными для вырожденного кода).Данные о замещениях аминокислот в структурных белках трех мутантов, возникших в результате включения в РНК 5-фтору рацила, согласуются с предполагаемым механизмом мутагенного действия этого агента, т. к. у Ц И А Г.

Далее

Неродствеппыо вирусы сильно различаются но частоте образования новых штаммов. Tait, у ВТМ имеется множество мутантов, тогда как вирус кустистой карликовости томатов представлен всего лишь несколькими штаммами. Различные штаммы одного вируса также порой сильно варьируют по способности образовывать мутанты. Так, некоторые штаммы Х-вируса картофеля, вызывающие хлоротические местные поражения ira листьях растений табака, часто образуют мутанты, вызывающие поражения типа кольцевой пятнистости; другие штаммы этого вируса вовсе не образуют таких мутантов [1167]. Штаммы вируса некроза табака, вызывающие белые некрозы на листьях растений коровьего гороха, часто превращаются в штаммы, вызывающие красные некрозы [584]. Поражение этого последнего типа всегда первоначально возникает как пятно в форме сектора в области белого некроза. Частота образования «красных» мутантов варьирует в Г> рая в зависимости от природы «белого» штамма. Обратный процесс (превращение «красных» штаммов в «белые») не наблюдался.

Далее

Оказалось, что по данным об аминокислотном составе структурного ■белка эти шесть исследованных штаммов делятся на такие же две группы, как и по данным о частоте встречаемости олигонуклеотидов в РТГК. Поскольку данные о штаммовых различиях РНК отражают изменения в той большей части генома, которая не имеет отношения к кодированию структурного белка, мо?кпо с достаточным основанием полагать, что у вирусных штаммов этой группы частоты мутаций в цистронах структурных и неструктурных белков приблизительно равны.

Далее

Различие и сходство биологических свойств изолятов вирусов могут контролироваться той частью вирусного генома, которая не имеет отношения к синтезу белка оболочки, так что можно ожидать, что исследование биологических свойств вирусов позволит обнаружить такие различия между штаммами, которые не выявляются с помощью химических или физических методов.

Далее

Почти все из упомянутых в этой главе химически индуцированных мутантов ВТМ можно считать дефектными в том смысле, что они в процессе репродукции образуют меньше вирусных частиц, чем родительский штамм. Яти мутанты были взяты для исследования потому, что из образующихся частиц можно было выделить структурный белок для изучения аминокислотных замещений. Около 2/я мутантов, идентифицированных по симптомам болезни, не содержали никаких изменений в структурном белке. Причина пониженной продуктивности многих мутантных штаммов не известна. Вполне возможно, что в РНК-цодимеразе или каком-либо другом вирусоспецифичном ферменте происходит замещение той или иной аминокислоты, что приводит к снижению функциональной активности фермента и как результат — к снижению урожая вируса. Мутация, приводящая к синтезу пефувкциопирующей ТЛИ i-полимеразы, должна быть летальной, так как в этом случае вирусная РНК. не синтезируется, мутация же, приводящая к нарушению функции структурного белка, может и не быть летальной, если каким-то образом будет обеспечена сохранность вирусной РНК внутри клетки. Несколько мутантов такого рода были выделены.

Далее

Химические механизмы, определяющие специфичность вирусов в отношении хозяина, неизвестны, однако исследования Уонга и Найта [18Н1] свидетельствуют о том, что в ряде случаев приуроченность природных штаммов к тем или иным растениям может коррелировать со специфическим характером структурного вирусного белка. Авторы исследовали 13 изолятов ВТМ, полученных из растений томатов, выращенных в полевых условиях в ряде стран. Судя по аминокислотному составу и пептидным картам, структурные белки всех отих изолятов очень близки. Особый интерес представляет тот факт, что, во-первых, С-концевой аминокислотой в структурных белках всех изолятов оказался cepmr, а пе треонин, как это имеет место в бел пах большинства штаммов ВТМ, и, во-вторых, в белках всех изолятов присутствовал метионин, тогда как типичный штамм ВТМ метионина не содержит. Указанные особенности структурных белков исследованных изолятов, но-видимому, не играли определяющей роли в способности этих вирусов инфицировать растения томатов, так как и типичный штамм ВТМ успешно инфицирует растения этого вида. Одпако эти особенности структурных белков связаны, очевидно, с некоторыми неизвестными свойствами томатных штаммов, способствующими их выживанию в полевых условиях при инфицировании этого растения-хозяина. В отличие от томатных штаммов аминокислот-ный состав белков семи орхидных изолятов ВТМ варьировал в широких пределах: состав структурных белков одних изолятов оказался очень близким составу белка типичного штамма ВТМ , а в белко других изолятов были обнаружены многочисленные аминокислотные замещения [908]. Возможно, вариации аминокислотного состава связаны со специфической ассоциацией данного пгтамма с том или иным родом орхидных., однако для того, чтобы сделать обоснованный вывод о том, что различия аминокислотного состава отражают адаптацию пгтамма к данному виду растения-хозяина, необходимы дополнительные исследования.

Далее

В настоящее время пе представляется возможным использовать для построения генетической карты вирусов растений методы, успешно применяемые в исследованиях бактериофагов и некоторых вирусов животных. Выть может, открытие многокомпонентных систем позволит провести подобного рода генетический анализ (гл. VIII).

Далее

Впервые генетическая рекомбинация у вирусов была обнаружена при исследовании крупных ДНК-содержащих бактериофагов (например, Т2), инфицирующих Е. coli. В этих исследованиях бактерии инфицируют двумя мутантными штаммами одновременно и при равных множественностях заражения. Эти два штамма отличаются по крайней мере по двум легко идентифицируемым генетическим маркерам. Затем исследуется потомство фагов, и если часть его содержит оба маркера, считается, что имела место рекомбинация между двумя фагами. Частота рекомбинации измеряется отношением числа рекомбинантных частиц к общему числу частиц, образовавшихся при скрещивании. Частота рекомбинации зависит от расстояния между маркерами, условий эксперимента (в особенности от числа скрещиваний к моменту анализа потомства), а также от множественности заражения и от соотношения двух штаммов в ииокулуме.

Далее

Существует общепринятая точка зрения, согласно которой иммунность, растения к вирусу связана с присутствием в тканях защищающего вируса.. Если но какой-либо причине растение или его часть освобождается от защищающего вируса, растение приобретает восприимчивость как к повторному заражению защищающим штаммом, так и к инфекции другими штаммами. Таким образом, проблема перекрестной защиты близко связана с вопросом о том, могут ли два родственных вируса заражать одну и ту же клетку и репродуцироваться в ней. Для того чтобы дать определенный ответ на поставленный вопрос, необходимо, заразив одну и ту лее клетку двумя штаммами одновременно или последовательно, исследовать природу штаммов, образующихся в таких клетках. В настоящее время провести подобные эксперименты с вирусами растений не представляется возможным.

Далее

Результаты изучения искусственно индуцированных температурочувствительных мутантов ВТМ, которые обсуждались выше, могут помочь составить некоторое представление о механизме действия температуры на природные штаммы вирусов. Штаммы, не способные эффективно репродуцироваться при более высоких температурах, имеют аминокислотные замещения либо в структурном белке, что не позволяет этому белку нормально участвовать в образовании палочковидных вирусных частиц, либо в том или ином; ферменте, программируемом вирусным геномом (например, в РНК-полиме-разе), что приводит к неспособности фермента нормально функционировать при более высоких температурах (или — в случае термофильных штаммов — при более низких температурах).

Далее

Многие агенты вызывают потерю характерных структурных и биологических свойств вирусов и могут препятствовать их проникновению в растение и последующему размножению. Исследование способов воздействия различных инактивирующих агентов на вирусы дало нам полезную информацию, касающуюся структуры вирусов и процесса репликации их в растении. Такие исследования позволили также высказать предположения о возможных механизмах, обусловливающих устойчивость растений к вирусной инфекции, и способах освобождения растений от вируса или защиты их от инфекции.

Далее

Начиная с самых ранних этапов исследования вирусов растений в качестве признака, служащего для идентификации вирусов, использовали так называемую «термальную точку гибели», причем опыт проводили в свеже-•отжатом соке листьев. Для различных вирусов самые высокие температуры, при которых после нагревания в течение 10 мин еще можно обнаружить некоторую инфекционность, лежат в пределах 40—95 °С, а для многих из них — в пределах 50—60 °С. Концентрация вируса в исходном материале, pH и состав сока, характер материала, используемого для разбавления, состояние испытуемых растений — все это может влиять на результаты подобного рода исследований. Для более детального изучения процесса тепловой инактивации вирусов используют очищенные вирусные препараты.

Далее

Вопрос о влиянии изменения температуры на чувствительность расте-ний-хозяев к штфекции, а также на репликацию вируса мы рассматривали в гл. XII. В гл. XIII были описаны чувствительные и устойчивые к температуре штаммы. В этом разделе рассматривается вопрос о влиянии высокой температуры на вирус, находящийся в растении.

Далее

Для исследований процесса инактивации вирусов растений изучали действие на эти частицы различных ионизирующих (а-частицы, 7- и рентгеновские лучи) и пеионизиругощих излучений (ультрафиолетовые лучи и видимый свет). Поглощение ионизирующего излучения зависит только от порядкового номера атомов, входящих в состав вещества, по не зависит от химической структуры, частью которой эти атомы являются. Поглощение неиони-зирующего излучения зависит от химической структуры. Доля инфекционных частиц, сохраняющих свою активность после облучения, является экспоненциальной функцией дозы [1054]. Степень инактивации, обусловленной действием излучения, зависит не от его интенсивности, а от общей дозы, получениой. препаратом. Ионизирующее излучение может действовать на большие молекулы (например, вирусы) либо непосредственно, изменяя структуру вируса (прямое действие), либо косвенно, вызывая образование коротко-живущих химически активных радикалов в среде, окружающей вирус.

Далее

Вирусы растений инактивируются при облучении ультрафиолетом in vitro. Инактивация имеет место при дозах излучения, которые не влияют на основные физические, химические и серологические свойства вирусной частицы. Реакция инактивации характеризуется кинетикой первого порядка, однако, как подчеркивал Клечковский [989, 991], это не обязательно означает, что вирусная частица инактивируется в результате поглощения одного кванта энергии. Квантовые выходы для вирусов растений (и для других вирусов) невелики [989]. Так, в среднем для инактивации частицы ВТМ требуется, чтобы она поглотила 15 000—30 000 квантов, а для инактивации частицы вируса южной мозаики фасоли — примерно 9000 квантов [1363]. Клечковский [989] предположил, что в результате вызываемого облучением возбуждения в различных частях молекулы она переходит в некоторое неравновесное состояние, в котором инактивация может произойти в любой момент времени. Поглощенная энергия может вызвать либо временное, либо постоянное изменение (последнее может быть летальным или нелетальным) или же она может рассеяться в виде тепла.

Далее

Хотя видимый свет сам но себе обычно не приносит вреда, уже давно известно, что в присутствии некоторых красителей клетки и вирусы становятся чувствительными к свету и инактивируются под его действием. Инактивация под действием: видимого света характерна как для вирусов растений, так и для изолированной из них PIIK [364, 1289, 1292]. На фиг. 59 можно видеть, как повышается скорость инактивации ВТМ на свету.

Далее

Белковая часть вируса не денатурировала при обработке ультразвуком, поскольку белок сохранял способность реагировать с антисывороткой к ВТМ. Было обнаружено, что обработанный таким образом вирус связывал большее количество антител, присутствующих в этой антисыворотке, чем интактный вирус [1138]. Это происходит, вероятно, вследствие увеличения доступной поверхности и более тесной упаковки молекул антител при взаимодействии с более мелким антигеном.

Далее

Если растворы очищенного ВТМ разбрызгать па какую-то поверхность, температура которой поддерживается на низком уровне (от —22 до —15 °С), а затем лиофилизовать, то многие палочкообразные частицы разрушаются до мелких фрагментов [1423]. Механизм этого разрушения неясен, однако многие частицы по своему внешнему виду похожи на вирусные палочки, частично депротеипизированные под действием щелочи. Тем не менее лиофи-лизацию при контролируемых условиях можно использовать для длительного хранения некоторых нестабильных вирусов.

Далее

Многие белки денатурируются, если подвергнуть их в течение короткого периода действию давления в 5000—10 ООО атм. ВТМ также инактивируется при высоких давлениях (около 8000 атм) [88, 1048]. При температуре 30 °С, pH 7,0 и давлении 5000—10 000 атм реакции инактивации и коагуляции ВТМ подчиняются кинетике первого порядка. По мере коагуляции происходит высвобождение РНК. Таким образом, действие высоких давлений на вирус сходно с действием нагревания. Температура и давление взаимодействуют в ходе процесса инактивации. Например, при более низких температурах (30 °С) скорость денатурации увеличивается по мере увеличения давления, тогда как при 68,8 °С она уменьшается с увеличением давления до 680 атм [884].

Далее

Много лет в качестве одного из критериев при идентификации вирусов использовали промежуток времени, в течение которого экстракт из инфицированной вирусом ткани сохранял в какой-то мере инфекционность, т. е. был устойчив к инкубации при комнатной температуре. Теперь подобного рода критерии используются редко и применяются только в отношении тех вирусов, которые еще но охарактеризованы с помощью более точных методов. Принимая во внимание, что обычно исследовали нестерильные и неочищенные экстракты, становится очевидным, что па процесс инактивации могли оказывать влияние многие факторы. К их числу относятся величина pH экстракта и изменение значения pH со временем, а также действие протеаз и нуклеаз, которые, возможно, присутствовали в экстракте с самого начала либо появлялись в нем позднее, освобождаясь из клеточных компонентов или из микроорганизмов, загрязняющих этот экстракт. Нитзани и Фридмен [1273] высказали мысль, что для оценки стабильности экстрактов следует использовать промежуток времени, в течение которого их инфекционность снижается на 50%, а не тот длительный период, на протяжении которого инфекционность сохраняется. В принципе это достаточно удовлетворительный критерий; однако в случае неочищенных экстрактов, в которых на стабильность вирусов влияет так много различных факторов, сомнительно. стоит ли проводить столь трудоемкую работу, чтобы получить кривую инактивации, пригодную для оценки лишь одного исследуемого образца.

Далее

Осаждение вирусов из растворов в изоэлектрической точке может приводить к заметной потере инфекционности (фиг. 61, Б), однако инфекцион-1хость может восстанавливаться до нормы при подведении pH раствора к значениям, при которых вирус снова переходит в раствор.

Далее

Устойчивость вирусов в окислительной или восстановительной среде бывает различной. При осторожной обработке ВТМ перекисью водорода можно получить неияфекционпые вирусные препараты, полностью сохранившие серологическую активность. ВТМ более устойчив к денатурации под влиянием этого реагента, чем Х-вирус картофеля [99]. Вирусы, нестабильные при действии других реагентов (например, вирус бронзовости томатов; фиг. 63), часто оказываются очень чувствительными к изменению окислительных или восстановительных свойств среды.

Далее

ВТМ, причем в основе механизма инактивации лежит, по-видимому, тот же процесс, что и при мутагенном действии, а именно дезаминирование оснований. Мягкие условия обработки незначительно влияют на серологическую активность вируса, однако содержание аминогрупп в белке может при этом снижаться. При более жестких условиях вирусная частица разрушается. Шустер и Шрамм [1512] в своих исследованиях изучали ту скорость, с которой вирусные частицы утрачивают инфекционность, а также скорость дезаминирования аденина, гуанина, цитозина и пришли к выводу, что для инак-тивировапия целой молекулы РНК ВТМ достаточно дезаминирования одного нуклеотида примерно па каждые 3000 нуклеотидов без расщепления цепи РНК.

Далее

Реакция ВТМ с иодом при соответствующих условиях приводит к окислению ЭН-групп в вирусном белке с образованием в—Э-связей, но утраты инфекционности нри этом не наблюдается. При несколько более жестких условиях (более высокая концентрация иода или повышенная температура) остатки тирозина превращаются в дииодтирозин и вирусные частицы теряют инфекционность [29]. Инактивация, но-видимому, не связана непосредственно с изменениями, происходящими в вирусном белке, а обусловлена какими-то еще не идентифицированными изменениями в РНК.

Далее

На стабильность препаратов инфекционной РНК ВТМ заметно влияют условия ионной среды, в которой проводится инкубация. Препараты в значительной степени теряли свою ипфекциопность в случае инкубации при 3(>0 в течение 1 ч в 0,1 М растворе соли, однако были более стабильны 1) 0,01 М и еще более — в 0,001 М буфере [540]. С другой стороны, при действии растворов солей высокой концентрации (1—2 М) возникал некоторый защитный эффект, который, возможно, был частично обусловлен агрегацией и осаждением РНК. Действие соли в этих экспериментах, по-видимому, объясняется ее влиянием на активность следов иуклеаз из листьев, которые присутствовали в препаратах РНК.

Далее

Было изучено множество синтетических органических соединений я природных веществ с целью определения инактивирующего воздействии на вирусы растений как in viLro, так и in vivo. Учитывая те возможности, которыми обладают все эти вещества (в смысле специфического антивирусного действия), основное внимание исследователей при изучении химических средств борьбы с вирусными болезнями было направлено именно на эту группу. Мы можем рассмотреть здесь лишь некоторые из многих изученных соединений. Их можно подразделить на три произвольные группы. В этом разделе мы рассмотрим главным образом простые синтетические органические соединения, далее метаболиты и антиметаболиты, а затем различные вещества биологического происхождения, обладающие ингибирующим действием.

Далее

Мочевина хорошо известна как агент, вызывающий денатурацию белка; считают, что она действует, ослабляя водородные связи и гидрофобные взаимодействия в молекулах белков [960]. ВТМ и другие вирусы деградируют в концентрированных растворах мочевины (около 6 М), теряя ипфекцжш-ность и серологическую активность [117, 1665]. Утрата значительной части инфекционности в этих ранних экспериментах была, возможно, обусловлена активностью загрязняющих препарат нуклеаз, а не действием мочевины на РНК. Инактивация ВТМ и Z-вируса картофеля при воздействии мочевины сопровождается отделением белка от РНК, однако в случае вируса кустистой карликовости томатов и вируса некроза табака этого не происходит.

Далее

Это соединение очень широко используется в качестве инактиватора вирусов животных при изготовлении: вакцин. Реагент этот очень удобен, так как он подавляет инфекционность вирусов, однако серологическая активность их при этом сохраняется.• Формальдегид является соединением с высокой реакционной способностью, которое может реагировать с различными группами как белка, так и РНК вируса.

Далее

Эти кислоты могут также служить фактором, ограничивающим проникновение 11 клетку некоторых вирусов и их размножение. Разбрызгивание на листья растений фасоли ряда органических кислот (в концентрации около 0,1 М) перед инокуляцией или примерно в течение 2 ч поело заражения приводит к значительному уменьшению числа местных некротических поражений, вызываемых вирусом некроза табака [1187]. Известно, что соединения, подобные лимонной или янтарной кислоте, образуют хелатные комплексы с ионами некоторых металлов, например с ионами кальция и магния. Ингибирующее действие подобного рода кислот можно снять путем добавления солей этих металлов. Так, вирус некроза табака, как и некоторые вирусы бактерий, нуждается для своего успешного развития в наличии ионов некоторых металлов. Однако Вилтшайр [1918, 1919] не обнаружил никакой корреляции между концентрацией различных органических кислот в листьях фасоли и изменением в чувствительности растений при заражении их вирусом некроза табака.

Далее

Воздействие додецилсульфатом натрия в мягких щелочных условиях приводит к отделению белка от РНК не только у частиц ВТМ, Х-вируса картофеля, по также и у вируса кустистой карликовости томатов [118, 1654]. В случае обработки ВТМ додецилсульфатом натрия при более четко определенных условиях (pH 8,5—8,8 и температуре 50 °С в течение нескольких минут) удается получить препараты инфекционной РНК [1540].

Далее

Влияние различных красителей и производных акридина на инактивацию вирусов in vitro мы уже рассматривали в связи с вопросом о воздействии видимого света. Некоторые соединения этого типа приводят к ослаблению вирусной инфекции и замедляют репликацию вируса in vivo [1268, 1734].

Далее

Основной трудностью при разработке эффективных химических мер борьбы с заболеванием является необходимость найти какое-то соединение, которое оказывало бы: летальное или токсическое действие на патогенные агенты, но при этом не вызывало бы серьезных нарушений в организме хозяина. Рассматривая различные типы синтетических соединений, которые могут оказывать специфическое ингибирующее действие на вирусы растений, представляется вероятным, что подобными возможностями должны обладать аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, встречающихся в РНК, поскольку именно РНК представляет собой генетический материал большинства вирусов растений.

Далее

Как показали наблюдения, ни одна из исследованных до сих пор аминокислот и ни один из аналогов аминокислот не обладают какой-либо заметной антивирусной активностью [1427, 1494]. Поскольку при синтезе белков клетки-хозяина и вирусных белков используются одни и те же аминокислоты, довольно трудно рассматривать вопрос о возможном механизме их специфического действия.

Далее

Актиномицин D в концентрации, при которой он ингибирует синтез клеточных РНК, не оказывает заметного влияния на синтез вирусов растений (например, ВТМ [1470], вирус крапчатости бобов фасоли [78]). Это не удивительно, поскольку этот антибиотик блокирует, как полагают, главным образом ДНК-зависимый синтез PITK. Однако при определенных условиях антибиотик ингибирует вирус желтой мозаики коровьего гороха (гл. VII) [1082].

Далее

Панкреатическая рибонуклеаза быстро инактивирует «голую» инфекционную РНК ВТМ. При очень высоких концентрациях фермента происходит также инактивация интактного ВТМ, несмотря даже на то, что РНК внутри вирусной палочки защищена от действия фермента in vitro.

Далее

Механизм действия подобного рода приписывали многим веществам, особенно неидентифицировашшм ингибиторам, присутствующим в клеточных экстрактах. Однако, вероятно, единственным примером, когда связывание, как было установлено, является необходимым этапом инактивации, служит образование комплекса между специфическим антителом и вирусом. Неясно, каким образом антитело инактивирует вирус, но оно может полностью предотвращать депротеинизацию РНК в клетке. К этой категории ингибиторов можно также отнести полиэлектролиты, например полилизии.

Далее

К этой группе относятся аналоги пуринов и пиримидинов, такие, как 8-азагуанин и 2-тиоурацил, однако детали механизма их действия неизвестны. Некоторые возможпые механизмы таковы: 1) нарушение спаривания оснований в репликативной системе во время синтеза вирусной РНК; 2) образование дефектной вирусной матрицы, приводящее к появлению нефункциональных или лишь частично функциональных вирусоспецифичных белков; 3) включение аналогов в антикодоны или в участки, предназначенные для узнавания ферментов на транспортных РНК, что приводит к возникновению ошибок при трансляции и в конечном итоге к появлению дефектных белков; 4) недостаточное снабжение предшественниками, необходимыми для синтеза РНК, в результате нарушения функций ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов.

Далее

Имеется целый ряд веществ, не обнаруживающих какого-либо действия на вирус in vitro, но препятствующих развитию инфекции, если их применяют до заражения растения или в период, примерно соответствующий времени его инокуляции. Часто полагают, что такие вещества блокируют участки, необходимые для проникновения вируса. Существование таких мест представляется чисто гипотетическим. В качестве альтернативы можно допустить, что подобного рода вещества изменяют процесс метаболизма, характерный для растения-хозяина. Однако это просто другой способ выражения нашей неосведомленности в этом вопросе. Можно представить себе три возможных объяснения механизма действия таких веществ: 1) они могут убивать клетки, поврежденные во время заражения, тем самым устраняя возможность для проникновения вируса; 2) эти соедииения могут способствовать удалению некоторых факторов (например, ионов двухвалентных металлов), необходимых для того, чтобы заражение произошло. Таким образом могут действовать и некоторые органические кислоты; 3) эти вещества могут воздействовать на проникшую в клетку вирусную РНК после ее освобождения из белковой оболочки. Вероятно, так действует рибопуклоаза, введенная в зараженный лист.

Далее

Как правило, крупные молекулы более иммупогеипы, чем мелкие. Так, вирусы растений, гшторые представляют собой белковые макромолекулы, весьма эффективно индуцируют образование специфических антител. Субъединицы вирусного структурного белка значительно мснео эффективны в этом отношении.

Далее

Мы не располагаем убедительными данными о том, что РНК вирусов-, растений может индуцировать образование специфических антител. Антитела, образующиеся в ответ на введение животному того или иного из вирусов растений, реагируют либо с вирусным белком, либо с интактным вирусом, либо с различными продуктами частичной деградации иптактной белковой оболочки.

Далее

Так как структурный белок ВТМ мояшо получать в больших количествах и для него известна полная последовательность 158 аминокислот, этот вирус представляет собой весьма удобный объект для детального изучения центров связывания. При решении этой проблемы использовали три подхода.

Далее

Аах [1] также показал, что антисыворотка к А-белку, адсорбированная ВТМ (или агрегированным А-белком) и не дающая реахщии преципитации с этими антигенами, продолжает реагировать с не агрегированным А-белком. Это свидетельствует о том, что у А-белка имеется антигенная группировка, которая в интактном вирусе скрыта. Другие авторы не смогли воспроизвести этот результат, возможно потому, что пользовались иными антисыворотками. А-белок часто образует две полосы преципитации (фото 81, А) или больше двух.

Далее

Для вирусов растений, в отношении которых могут применяться серологические тесты, последние служат обычным критерием для установления родства между двумя вирусными изолятами. Можно использовать любой из описанных выше тестов, но чаще всего применяется одна из модификаций реакции преципитации. Тщательно поставленные серологические тесты весьма полезны для классификации вирусов. Серологические свойства вирусов, как правило, хорошо коррелируют с другими свойствами этих объектов (гл. XX). •Однако при использовании серологических методов следует иметь в виду ряд важных моментов.

Далее

Соединение вирусных антигенов со специфическими антителами, происходящее внутри клеток, нельзя наблюдать, если не пометить молекулы антител каким-либо способом. Предложено много различных меток, с помощью которых можно добиться специфического «окрашивания», позволяющего •определить локализацию вирусного антигена в клетках и клеточных органел-лах. Применение этих методов связано с двумя основными трудностями. Во-первых, необходимо обеспечить проникновение конъюгата антител в клетку и его взаимодействие с вирусным антигеном. В отношении вирусов растений эта проблема исключительно сложна. И во-вторых, применение этих методов ■связано с различными неспецифическими воздействиями.

Далее

Для изучения внутриклеточной локализации вирусов и их распространения по тканям растения-хозяина и насекомого-переносчика применяют метод флуоресцирующих антител.Способность антител проникать в клетки мезофилла зависит от возраста листа. В клетки более старых листьев антитела проникают легко; проникновение их в клетки молодых листьев происходит лишь после фиксации последних в спирте, ацетоне или жидкости Карнуа. Этот метод оказался малопригодным для изучения внутриклеточной локализации вируса, но его можно с успехом применять для изучения распространения вируса в тканях. Недавно данный метод был использован в работе с протопластами клеток мезофилла, зараженных ВТМ [1299].

Далее

Основная трудность при работе этим методом связана с достижением эффективного проникновения конъюгированных антител в ткани растения, однако в будущем он обещает стать самым плодотворным методом изучения внутриклеточной локализации вирусных антигенов.

Далее

Беспозвоночные делятся на 22 типа, причем большинство видов, питаю-щихся на живых зеленых наземных растениях, относится к двум группам. Это нематоды (Nematoda) и членистоногие (Arthropoda). К этим типам относятся многочисленные переносчики вирусов растений. Еще два типа, кольчатые черви (Annelida) и моллюски (Mollusca), имеют несколько представителей, питающихся на растениях; возможно, среди них есть потенциальные переносчики, которые могли бы передавать вирус механическим способом.

Далее

Вначале мы рассмотрим переносчиков из класса нематод как наиболее примитивных, а затем — различных представителей ИоторЬега, начиная с тлей и цикадок, поскольку это наиболее важные группы насекомых-перенос-чиков и поскольку они изучены лучше всего.

Далее

В зонах с умеренным климатом тли часто мигрируют с первичного растения-хозяина, которым обычно бывает древесное растение, на травянистые растения. Жизненный цикл тлей характеризуется сменой большого числа форм. Ниже приводится полный цикл развития (табл. 18).

Далее

Уотсон [1870] и Уотсон и Робертс [1877, 1878] считают, что вирусы, распространяемые тлями, по-видимому, можно разделить на две группы — неперсистентных и персистентных. Первые сохраняются в переносчике только в течение короткого периода, меньшего, чем период сохранения вируса в необработанных экстрактах листьев, тогда как вторые могут находиться в насекомых долгое время, иногда в течение нескольких недель или месяцев.

Далее

Главная особенность этого типа передачи состоит в том, чти тля может получить вирус после очень кратковременного питания на больном растении и немедленно передать его одному или нескольким здоровым растениям. Способность передавать вирус быстро утрачивается. Эффективность передачи часто увеличивается в том случае, если перед тем, как поместить тлей па больные растения, их некоторое время выдерживают без пищи. Для приобретения вируса длительные периоды питания па больных растениях могут быть менее аффективными, чем короткие. В табл. 20 приводятся некоторые данные, взятые из классической работы Уотсон и Робертса [1877].

Далее

При линьке тли ее хитиновый покров сбрасывается вместе со стилетами, причем сбрасывается также выстилка переднего и заднего отделов кишечника. Таким образом, вирусы, сохраняющиеся после линьки, должны находиться в среднем отделе кишечника или в каком-либо другом участке тела насекомого. Если инфекционность сохраняется и после линьки, то вирус относят к группе циркулирующих. .

Далее

По обе стороны брюшка находится по мицетому; функции этого образования неизвестны. Жировое тело, которое, возможно, выполняет запасающую функнию, окружает все органы головного и грудного отделов, а также брюшка. Пищеварительный тракт состоит из трех основных отделов: переднего кишечника, среднего кишечника и заднего кишечника (фиг. 79).

Далее

Первый вирус растений, о котором стало известно, что он размножается в организме переносчика, передавался цикадкой. Несколько других детально изученных к настоящему времени вирусов также относятся к группе пропагативпъгх вирусов, т. е. размножаются в переносчике. Разумеется, все они в то же время являются и циркулирующими вирусами. Однако известен один вирус, который, вероятно, передается цикадкой с помощью стилета, а также вирус, который, по-видимому, только циркулирует, но не размножается в переносчике.

Далее

Показано, что Micrutalis sp. передает псевдоскручивапие верхушки томатов [1589, 1591]. Однако позднее было установлено, что возбудителем-этого заболевания является не вирус, а микоплазмоподоблый организм.

Далее

В Индии белокрылки являются чрезвычайно важной группой перонос-чиков. В. tabaci передает вирус курчавости листьев табака, вирус желтой сетчатости табака и некоторые другие. Варма [1839] показал, что особи этого-вида могут содержать в себе и передавать одновременно два разных вируса.

Далее

Эти насекомые гораздо менее подвижны на растении, чем тли и цикадки; поэтому как переносчики вирусов они сравнительно малоэффективны. С одного растения на другое червецы и щитовки переходят только в том случае, если растения так или ипаче соприкасаются. Ползающие нимфы передвигаются быстрее, чем взрослые насекомые. Кокцидн могут переноситься с одного растения на другое муравьями. Иногда они переносятся на довольно большие расстояния ветром [1766].

Далее

Вирусы, передаваемые тлями с помощью стилета, переносятся в определенном смысле механически, по специфичность взаимосвязи между тлями, вирусами и штаммами вирусов показывает, что передача с помощью стилета представляет собой явление более сложное, чем пассивный перепое вирусов при простой механической инокуляции. Относительно передачи вирусов тлями имеется один неясный вопрос: совершенно непонятно, почему такие вирусы, как ВТМ, Х-вирус картофеля и вирус желтой мозаики турнепса, не передаются этими насекомыми, несмотря на то что они сравнительно стабильны, накапливаются в растениях в высокой концентрации и легко передаются путем механической инокуляции.

Далее

Это крайне специализированные паразиты растений. Известно, что представители этого семейства передают по крайней мере шесть вирусов растений. Они питаются, прокалывая стилетами растительные клетки и высасывая их содержимое. Стилеты заключены внутри выемки хоботка, имеющего два утолщения, которые действуют в качестве слюнных протоков (фото 90). У этих клещей две нары ног; глаза, сердце, экскреторная и дыхательная системы у них отсутствуют.

Далее

Известно несколько случаев, когда заражение растения вирусом приводило к тому, что оно становилось более пригодным для роста и репродукции пасекомого-переиосчика.Развитие популяций Aphis fabae на здоровых растениях сахарной спекли (II) и па растениях, зараженных iuijjycoM мозаики (J) за 12 дней но того, как па них помещали тлей. Ни пси ординат отложено общее число тлей на растениях (или только что переселившихся с них).

Далее

Для того чтобы вирус мог продолжать свое существование, необходимо подходящее растение, в котором он может размножаться, эффективные способы распространения и заражения, а также резерв соответствующих расте-ний-хозяев, поражая которые, он может распространяться. Существующая в действительности ситуация, определяющая развитие каждого данного вируса в какой-то определенной местности или в мировом масштабе, является результатом сложного взаимодействия многих физических и биологических факторов. В этой главе мы кратко рассмотрим наиболее важные из них и проиллюстрируем те способы, благодаря которым они могут взаимодействовать друг с другом и оказывать, таким образом, влияние на распространение вирусов растений. Понимание экологии вируса в применении к отдельной культуре и 14 определенной местности важно для разработки соответствующих методов борьбы с вызываемым вирусом заболеванием. Как и в отношении большинства других облигатных паразитов, основными экологическими факторами, которые следует рассматривать, обычно считают пути передачи вирусов от растения к растению, а также способы, с помощью которых другие факторы воздействуют на распространение виругов.

Далее

Мы уже рассматривали различные группы беспозвоночных-нереносчи-ков (гл. XVI), а также грибы (гл. VI), которые являются переносчиками вирусов. С экологической точки зрения лучше говорить о двух группах этих переносчиков — тех, которые распространяют вирусы через почву (от одних корней к другим), и тех, которые переносят их через воздушную среду. Следует рассмотреть и третью возможность — распространение вирусов на большие расстояния. Особая роль здесь принадлежит человеку, не говоря уже о том, что он принимает участие и в механическом распространении вирусов.

Далее

На поражаемость какой-либо культуры вирусной болезнью значительное влияние могут оказывать методы ее выращивания и способы обработки, применяемые в той или иной зоне в течение всех четырех сезонов. Конечно, соответствующие приемы возделывания могут помешать распространению инфекции. При этом возникает множество различных ситуаций. Влияние различного рода факторов, которые имеют в данном случае значение, мы проиллюстрируем ниже на нескольких примерах.

Далее

Озимая пшеница, посеянная в обычные сроки (первые две педели сентября), сильно пострадала от вирусной инфекции. Осенью погода также была не такой, как обычно, что способствовало интенсивному распространению вируса клещами. Средняя температура в сентябре была 34,5 °С (на 5,5° выше среднего уровня за 30 лет). Такие необычно высокие температуры продолжали отмечаться и в октябре.

Далее

Сохранение вируса в течение зимнего периода может осуществляться по-разному. Существуют вирусы, способпые перезимовывать с помощью нескольких различных способов.Томная зона — период, в течение которого могут быть приняты аффективные моры борьбы; прерывистыми ливиями отмечено время, и течение которого проблема заражения осложняется наличием растений падалицы и либо рано посеянной озимой пшеницы, либо поздно созревающих кортов яровой пшеницы и ячменя; стрелками обозначена передача вируса клещами, которые переносятся ветром.

Далее

Очевидно, что если посевной или посадочный материал свободен от вируса и в поле отсутствует источник инфекции или отсутствуют пути для ее распространения, то самой проблемы защиты растений от вируса не возникает. Проводить меры с целыо уничтожения источника инфекции в поле имеет смысл лишь тогда, когда нам точно известна природа этого источника и то, каким путем вирус может распространиться из мест резервации на посевы.

Далее

В тех случаях, когда вирус передается через семена, этот источник инфекции может играть весьма важную роль, поскольку распространение инфекции на другие растения начинается очень рано, когда растения эти еще совсем молодые. Если зараженные семена являются главным или единственным источником вируса и если растения при этом можно выращивать в достаточной изоляции от внешних резерваторов инфекции, то использование семян, свободных от вируса или зараженных лишь в очень небольшой ■степени, представляет собой весьма эффективный способ борьбы с болезнью.

Далее

Визуальное выявление вирусного заболевания по симптомам не является надежным методом при селекции исходных растений. Более надежные методы идентификации здоровых и зараженных растений необходимы, и они существуют. Какой из них следует применить в каждом частном случае, это зависит от вируса и от растения-хозяина. Идентификация многих вирусов (в особенности тех, которые поражают древесные породы) — весьма трудоемкое дело. Основным методом является в этом случае прививка одному или нескольким индикаторным растениям. Распределение вируса по дереву, ■особенно на ранних стадиях инфекции, может быть неравномерным; поэтому, для того чтобы убедиться в отсутствии вируса, необходимо повторять эти тесты в течение нескольких лет. Так, Хамптон [700], прививавший по четыре почки с исследуемого растения на каждое индикаторное дерево, обнаружил, что в течение первого года вирус карликовости сливы на растениях вишни определялся не всегда (29—63%, в зависимости от сорта). Вероятность выявления инфекции н значительной степени возрастала в том случае, когда дерево было заражено уже в течение трех лет. Неравномерное распределение вируса может иметь место к у травянистых растений (гл. VII). Бимстер [138], в .частности, обнаружил, что при заражении картофеля У-вирусом инфицируются не все клубни и даже не обязательно все части одного и того же клубня. Нижняя часть клубня бывает заражена реже, чем верхушка. Таким образом, верхушка клубня является более падежным материалом для тестирования.

Далее

Другой пример такого же рода касается вируса желтой карликовости лука. Эта культура выращивалась в 1939—1945 гг. в Новой Зеландии в одном из районов поблизости от Крайстчерча. В результате сильных вспышек заболевания культура лука в этом районе была запрещена, а все несобранные луковицы и лук-шалот было решено уничтожить. Эти мероприятия привели к полному исчезновению названного заболевания в данном районе [348]. С тех пор сообщений о нем не поступало.

Далее

Инсектициды. В борьбе с насекомыми, вредящими растениям, применяется большое число различных инсектицидов. Чтобы, уничтожить насекомых, причиняющих какой-либо культуре прямой ущерб, необходимо просто понизить численность их популяции до такого уровня, при котором этот ущерб уже не будет иметь существенного значения. Гораздо более трудной проблемой является борьба с насекомыми — переносчиками вирусов, так как для распространения вируса достаточно сравнительно небольшого числа крылатых особей. Инсектициды контактного действия дают надлежащий эффект лишь при многократной обработке растений. Более перспективными в смысле защиты от вирусных болезней представляются персистентные инсектициды, особенно в том случае, если они передвигаются по проводящей системе растения. Различные вирусы часто заносятся в культуру крылатыми тлят, которые, питаясь, могут заразить растение при первом же контакте с ним, до того, как сами они погибнут от действия инсектицида. Если вирус передается стилетом, то севшая на растение тля быстро утрачивает инфекциопиость, и в таком случае уже не существенно, будет ли она после этого уничтожена или нет (если иметь в виду заражение культуры извне).. Иначе обстоит дело с тлями, которые передают циркулирующий вирус. Такие тли обычпо способны заразить большое число растений, и потому их уничтожение при питании на первом же растении будет ограничивать распространение инфекции.

Далее

Цветная вклейка 1 иллюстрирует поразительный эффект генетической устойчивости, который можно наблюдать в поле в период сильной эпифитотии.В некоторых случаях работа по выведению устойчивых сортов увенчалась крупным успехом. Вирус мозаики сахарного тростника представлял собой серьезную угрозу для этой культуры до тех пор, пока на Яве не были обнаружены устойчивые сорта P.O.J, иа основе которых были затем созданы новые устойчивые сорта [1703]. В то же время Рассел [14611 среди 100 000 растений не смог обнаружить ни одного, устойчивого к вирусу желтухи сахарной свеклы. Позднее, правда, он сообщил, что среди линий, толерантных к вирусу, ему удалось найти растения, в известной мере устойчивые к вирусам желтух [1463].

Далее

Заражение растения слабым штаммом вируса может иногда защитить это растение от сильного штамма того лее вируса. Некоторые исследователи предлагают поэтому специально заражать растения слабыми штаммами вируса в качестве защитного мероприятия. Такой прием, однако, может быть использован только в очень тяжелой ситуации. Для обычной практики его нельзя рекомендовать по ряду причин: 1) так называемые слабые штаммы часто снижают урожай примерно на 5—10%; 2) искусственно зараженные культуры могут служить источником вируса для растений других] видов и сортов; 3) в некоторых растениях доминирующий штамм вируса может изменить свои свойства и стать более агрессивным; 4) при смешанном заражении (если в культуру попадают неродственные вирусы) растения иногда бывают поражены очень сильно.

Далее

Значительные усилия были затрачены на поиски таких ингибиторов, которые, блокируя заражение растений и процесс репродукции вирусов, давали бы прямой эффект в смысло защиты культуры от вирусов, подобно тому как фунгициды защищают растения от патогенных грибов. В гл. XIV мы перечисляли типы испытанных соединений такого рода и обсуждали их действие.

Далее

В странах с высокоразвитым хозяйством установлен порядок, предотвращающий завоз новых заболеваний и распространение тех, которые здесь уже существуют. Сейчас во многих странах введены строгие правила с целыо препятствовать проникновению отдельных вирусов и их переносчиков, иногда из каких-то определенных государств или зон. Введение карантинных ограничений и принятие эффективных мер для их выполнения — сложная проблема. Экономические и политические факторы часто играют при этом немаловажную роль. Карантинные меры могут быть очень ценными в борьбе с теми вирусами, которые передаются семенами или сохраняются в покоящихся .вегетативных органах (например, в почках древесных пород). При совместных усилиях стран или областей, которые экспортируют и импортируют растительный материал, выполнение карантинных мер может быть очень действенным средством защиты от вирусных болезней растений.

Далее

На характер поражения отдельных спорофоров могут оказывать значительное влияние условия выращивания 11044], причем па лотках, на которых выращиваются грибы, образуются характерные зоны вокруг участков заражения. Рядом с участком заражения имеется центральная зона, на которой не растет ничего, кроме нескольких уродливых грибов. Зона, расположенная вокруг центральной, содержит большое число прекративших рост плодовых тел, которые преждевременно буреют. Кнаружи от этой зоны большинство грибов выглядит здоровыми, и только у некоторых из них четко выражены признаки заболевания, в частности их ножки становятся водянистыми. Рост на агаре замедляется (фото 94).

Далее

До тех пор пока Халл [844] в двух райопах Англии пе описал вирус, который поражал папоротник Phyllitis scolopendrium, вирусы, поражающие папоротники и другие папоротникообразные, описаны не были. На листьях больных растений папоротника, найденных Халлом, наблюдалась крапчатость, они были уже и для них была характерна морщинистость (фиг. 100).

Далее

Ряд вирусов, инфицирующих покрытосеменные растения, как оказалось, заражает и некоторые голосеменные растения; в природе у представителей этой группы обнаружено несколько вирусоподобных заболеваний, которые, вероятно, действительно вызываются вирусами.

Далее

При исследовании природных объектов люди стремятся дать им какое-то название и классифицировать их. Смысл классификации заключается в объединении объектов со сходными свойствами в группы; таким образом, всякая классификация — ото прежде всего система, облегчающая поиски информации. Если классификация составлена на основании адекватных критериев, то она отражает также эволюционные связи. Теоретически возможно рассматривать проблемы именования и классификации вирусов раздельно. На практике, однако, эти две задачи очень быстро начинают сливаться друг с другом. В течение последних сорока лет присвоение наименований вирусам растений и их классификация находились в более или менее хаотическом состоянии. До сих пор не разработана международная согласованная система. В 1930 году вопрос о необходимости такого соглашения был поднят на заседании V Международного ботанического конгресса в Кембридже (Англия) [887]. Однако до сих пор окончательного соглашения не удалось достигнуть ни одной международной комиссии, и хотя отдельные исследователи предлагали свои собственные системы, они не получили поддержки какой-либо группы или комиссии и ни одна из этих систем не стала общепринятой.

Далее

Поскольку нуклеиновая кислота является генетическим материалом-вируса, ее свойства должны в первую очередь приниматься во внимание как при распределении родственных вирусов в более крупные группы, так и при выявлении небольших различий в пределах групп.

Далее

До сих пор не установлено, содержат ли какие-либо вирусы растений структурные белки более чем одного типа. Будущие исследования, вероятно, позволят выявить такие вирусы (в частности, из числа крупных вирусов). Число и свойства структурных белков послужат важным критерием при создании системы вирусов.

Далее

Кроме РНК и белка, частицы некоторых вирусов растений содержат липиды или полиамины. Наличие этих соединений, их количество, химический состав и роль в структуре вируса могут служить критериями для классификации.

Далее

Для целей классификации изометрических вирусов морфология частиц, выявляемая при помощи электронного микроскопа, оказалась далеко не столь полезной, как в случае палочкообразных вирусов. Это связано главным образом с тем, что многие сферические вирусы имеют очень близкие размеры (диаметр около 25—30 нм) и внешне очень сходны. Морфологические различия удается выявить лишь при использовании препаратов и фотографии очень высокого качества. Однако в тех случаях, когда удается получить подробные сведения о симметрии и расположении субъединиц с помощью рентгеноструктурпого анализа или электронной микроскопии с высоким разрешением, эти параметры служат важным критерием для распределения изометрических вирусов по группам. Для крупных вирусов со сложной морфологией структура частицы, выявляемая методом электронной микроскопии, служит ценным указанием на возможные таксономические взаимоотношения. Разработка методов элоктронио-микроскопичоского исследования вирусов в неочищенных экстрактах растений [200, 800, 801] позволила значительно ускорить исследование строения вирусов, что в свою очередь имеет большую ценность для диагностики, особенно применительно к болезням, вызываемым палочкообразными вирусами.

Далее

В качестве критериев при составлении системы используют несколько независимо определяемых свойств вирусптлх частиц, зависящих от их состава и строения. Чаще всего это величина плавучей плотности, коэффициент седиментации и электрофоретическая подвижность.

Далее

Полезные сведения можно иногда получить, изучая инактивирующее действие различных реактивов на вирус. Вирусы, структура которых поддерживается главным образом за счет ионных связей между субъединицами, разрушаются концентрированными растворами солей. Напротив, вирусы, структура которых поддерживается в основном за счет гидрофобных взаимодействий, стабилизируются в концентрированных солевых растворах, и вызвать их деградацию можно, например, мочевиной.

Далее

Исследования, проведенные сравнительно недавно (гл. VIII), позволяют предположить, что типы частиц, образующихся при вирусной инфекции, и их функциональная роль послужат важным критерием при установлении различных групп вирусов. Например, вирусы группы ВЖМТ продуцируют значительное количество пустых белковых оболочек, пе содержащих РНК. У других вирусов существование двух или более вирусных частиц может быть следствием фрагментированного состояния генома. Например, у вирусов группы мозаики тыквы РНК распределена между двумя частицами. У вирусов группы погремковости табака РНК распределена между двумя палочкообразными частицами — длинной и короткой.

Далее

До тех пор пока для целей классификации вирусов использовались такие биологические характеристики, как совокупность симптомов и спектры рас-тений-хозяев, существовала значительная неопределенность в идентификации и классификации вирусов. По мере накопления знаний о физических и химических свойствах вирусов роль чисто биологических свойств в качестве критериев при построении системы вирусов уменьшалась. В настоящее время кажется совершенно очевидным, что проявление вирусной инфекции па растении, вероятно, ость выражение активности особых белков, кодируемых вирусной РНК. По этой причине симптомы и прочие проявления жизнедеятельности вируса в растении должны приобрести определенное значение для целей классификации вирусов. Мы пока не знаем, какую роль можно приписать тому или иному симптому или различию в симптомах. Это одна из причин, заставляющих сейчас отдать предпочтение обсуждаемому ниже подходу к классификации вирусов, предложенному Адансоиом.

Далее

В последние годы выяснилось, что все или почти все вирусы передаются в природе только одним типом переносчика (гл. VI и XVI). Немногочисленные сообщения о том, что вирусы переносились представителями двух различных групп членистоногих, нуждаются в проверке. Тип переносчика служит весьма устойчивым признаком, полезным при выделении основных групп вирусов. Однако в пределах данной группы вирусов или вирусных штаммов могут существовать значительные различия в эффективности и возможности передачи одним переносчиком данного вида. Способ передачи инфекции переносчиком (с помощью стилета или циркулятивным путем у тлей, па наружных покровах, в спорах грибов и т. д.) служит дополнительным критерием при классификации вирусов.

Далее

Известно два общих принципа классификации организмов. Один из них— иерархический принцип — лежит в основе классической лшшеевской классификации растений и животных. Это логическая система, в которой так или иначе делаются заключения об относительной важности различных признаков, которые затем используются для включения систематической единицы в определенный класс, порядок, семейство, род и т. д. Система, предложенная Адансоном [6], исходит из противоположного принципа: она основана на допущении равноценности всех признаков. Существуют различные мнения относительно этих двух подходов к классификации вирусов [618, 1111].

Далее

Эта схема критиковалась с различных точек зрения [1322]. Основная трудность, связанная с применением этой или любой другой подобной ей системы, состоит в отсутствии научной основы для установления относительной важности различных признаков. В самом деле, вполне возможно, что самые важные свойства вирусов нам просто неизвестны. Например, в 1965 году, когда была предложена упомянутая выше схема, не было известно, что генетический материал вирусов может быть распределен среди нескольких частиц. Сразу же возникает вопрос, что важнее — число фрагментов генома или тип симметрии белковой оболочки? По-видимому, введение описанной схемы было бы преждевременным, она, несомненно, потребовала бы серьезных периодических изменений, и тем самым нынешняя запутанная ситуация нисколько не разрешилась бы.

Далее

Одна из главных причин, по которой латинская биноминальная система номенклатуры в настоящее время неприложима к вирусам, состоит в том, что название вируса должно было бы одновременно служить его обозначением и содержать некоторые сведения о нем. Однако при современном состоянии знаний (вернее, при отсутствии их для большинства вирусов) неизбеяшо потребовалось бы периодически изменять эти названия. Пытаясь преодолеть эту трудность, Гиббс и др. [618, 621] разработали систему, в которой названия вирусов состоят из двух частей — первая часть представляет собой постоянное обозначение (общеупотребительное название), а вторая изменена в зашифрованную информацию, которую можно легко пополнять или заменять по мере накопления новых данных. Каждая криптограмма состоит из четырех пар символов [616].

Далее

В списке вирусов растений, опубликованном Микологическим институтом [1164], числится 630 болезпей, вызываемых вирусами, а также заболеваний, вирусная этиология которых представляется вероятной. Для 457 из этих заболеваний известно, что опи передаются либо путем механической инокуляции, либо с помощью одного из беслозвоночных-переносчиков (или обоими способами), но сведения о свойствах частиц возбудителя отсутствуют. Результаты исследований, обсуждавшиеся в гл. X, позволяют предположить, что около 60 из этих болезней, возможно, вызываются микоплазмо-подобными организмами, а не вирусами. В данный момент мы можем считать доказанным с высокой степенью вероятности вирусное происхождение 173 болезней, для которых имеются некоторые сведения о размере и форме вирусных частиц.

Далее

Хотя сейчас благодаря исследованиям структуры и репликации вирусов, а также молекулярной биологии нормальных клеток мы знаем об этой проблеме несколько больше, происхождение и эволюция вирусов все еще остаются в основном предметом умозрительных рассуждений. Тем не мепее яти вопросы пеизменпо вызывают большой интерес; кстати, они непосредственно связаны с проблемой классификации. Как указывал Пири [1366], большинство исследователей согласны между собой в том, что всякая классификация, если только она не преследует узкопрактические цели, должна иметь филогенетический смысл.

Далее

Высокоразвитый облигатный паразитизм вирусов, как мы представляем его себе в настоящее время, не дает оснований считать, что вирусы являются примитивными доклеточными формами жизни. Они используют тот же генетический код, что и клеточные организмы, синтез их белков зависит от рибосом, транспортных РЫК и соответствующих ферментов, поставляемых клеткой-хозяином (имеются сведения, что некоторые вирусы могут сами вносить в клетку одну или более необходимых для них транспортных РНК). В свое время при обсуждении вопроса о происхождении генетического кода было высказапо предположение, что примитивный код, возможно, был дублетным и кодировал 16 аминокислот в ранних белках. Когда код превратился в триплетный, в синтезе белка начали использоваться еще 4 аминокислоты [900]. Однако строение белка оболочек у вирусов растений но дает оснований говорить об их примитивности. Четыре аминокислоты, которые, как предполагалось, появились позднее в процессе эволюции (метионин, триптофан, тирозин и серии или аргинин), обнаруживаются у этих вирусов примерно стой же частотой, что и в белках других групп. Например, содержание триптофана — одной из тех аминокислот, которые встречаются в белках с низкой частотой, составляет (в приближенных процентных концентрациях) в бактериальном белке 0,8; в белке дрожжей 1,4; в белке водорослей 2,0; в белке цитоплазмы листьев ячменя 2,3 [214]. Среднее содержание триптофана в 6 капсидных белках вирусов растений составляет 1,2.

Далее

Часто предполагали, что вирусы могут вести свое происхождение от какого-то клеточного компонента, вышедшего из-под влияния нормальных регулирующих механизмов и превратившегося в самореплицирующуюся единицу. Иногда считается, что это могло произойти в тех самых клетках, в которых данный компонент обнаруживается обычно. Чаще высказывается предположение, что компонент нормальной клетки одного организма превращается в вирус при введении в клетки другого. Например, некоторые вирусы растений могли бы произойти из нормальных компонентов насекомых, питавшихся соком растений.

Далее