Метод центрифугирования в градиенте плотности, разработанный Брак-ке [259, 200, 202, 265], можно использовать как для выделения, так и для получения количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось, этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время широко используется в области вирусологии и молекулярной биологии. При проведении исследований методом центрифугирования в градиенте плотности центрифужную пробирку частично наполняют раствором, плотность которого уменьшается в направлении от дна к мениску. Для создания градиента при фракционировании вирусов растений наиболее часто используют сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут быть либо распределены во всем объеме раствора, либо нанесены на вершину градиента. Бракке [262] предложил три различных приема центрифугирования в градиенте плотности. При изопикпическом (равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор, пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность среды равна их собственной плотности. Таким образом, фракционирование частиц нроисходит в этом случае в соответствии с различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают достаточной плотностью для изопикнического разделения многих вирусов. При скоростном зональном центрифугировании вирус сначала наносят па предварительно созданный градиент. Частицы каждого типа седиментируют при, этом через градиент в виде зоны, или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и плотности. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное центрифугирование сходно со скоростным зональным центрифугированием, по в этом случае центрифугирование продолжается до достижения изопикнического состояния. Роль градиента плотности при скоростном центрифугировании заключается в том, чтобы препятствовать конвекции я фиксировать различные виды молекул в определенных зонах. Теория центрифугирования в градиенте плотности сложна и не совсем понятна [262]. На практике же это простой и изящный метод, который широко применяется при работе с вирусами растений. Для этого необходимы лишь высокоскоростная препаративная ультрацептрифуга типа вртсо Б50 и соответствующие бакет-роторы.[ ...]
С применением соответствующей ячейки можно выполнить эксперименты в градиенте плотности в аналитической центрифуге, использовав таким образом преимущества в чувствительности ультрафиолетовой оптики [1845]. При этом образец небольшого объема (15 мкл) вводится в колонку жидкости с высокой плотностью. Во время седиментации образуется градиент, гадторый стабилизирует зоны седиментирующих частиц. При такой процедуре удается обнаружить примерно до 0,2 мкг вируса или другого нуклеопротеида. Однако при этом нельзя препаративно выделить фракции градиента, как это делается при применении бакет-ротора.[ ...]
Вернуться к оглавлению