Многие условия и реактивы, применяющиеся для выделения вирусной РНК, могут быть также использованы для получения вирусного белка, в большей или меньшей степени свободного от РНК. Однако наилучший метод, применяемый для выделения интактной РНК данного вируса, обычно отличается от метода, позволяющего получать удовлетворительные препараты белка. Химическое и физическое состояние получаемого белка широк» варьируют в зависимости от вируса и применявшейся обработки. Можно получить несколько разных типов белковых продуктов: 1) иятактные белковые оболочки вируса, из которых удалена РНК; 2) нативные и в различной степени агрегированные химические субъединицы; 3) необратимо денатурированные белковые агрегаты, нерастворимые в водных растворах. Основным фактором, приводящим к образованию нерастворимых агрегатов, является образование дисульфидных мостиков между цистеииовыми остатками в белковых субъединицах вследствие окисления сулъфгидрилышх груяп. Образование дисульфидных связей между цепями может быть блокировано различными способами.[ ...]
Широкие различия в степени устойчивости разных вирусов к обработке ■67%-ной уксусной кислотой можно проиллюстрировать тем, что вирус мозаики дикого огурца, как было показано, не полностью диссоциирует на ■белок и РНК [1726, 1949, 1950] и при этом возникает нерастворимый продукт, тогда как вирус морщинистости турнепса вообще не деградируот. Мики и Найт [1205] показали, что в результате обработки вируса крапчатости конских бобов 66%-ной муравьиной кислотой в течение 18 ч при 37 °С образуется водорастворимый продукт, тогда как применение ряда других методов было безуспешным. В настоящее время существуют более эффективные способы получения белка из этого вируса [775].[ ...]
Белок большинства вирусов можно выделить в денатурированном состоянии путем соответствующей кислотной обработки. Например, нагревание до 90 °С в 5—10%-ной трихлоруксусной кислоте в течение 10 мин обычно приводит к деградации РНК до низкомолекулярного материала. Денатурированный белок может быть выделен путем осаждения этанолом.[ ...]
Обработка 1 М раствором хлористого кальция приводит к диссоциации и солюбилизации белка оболочки вируса крапчатости конских бобов [1951] и вируса мозаики костра [1952]. Белок, полученный этим способом из вируса мозаики костра, оказался, согласно данным седиментационного анализа, относительно стабильным димером химических субъединиц. Был разработан также простой метод получения низкомолекулярного белка из нескольких мелких изометрических вирусов; этот белковый препарат при реконструкции с РНК образует инфекционные вирусные частицы [775]. Белковые субъединицы из вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха, вируса мозаики костра и вируса крапчатости конских бобов были получены путем диализа вируса против раствора, содержащего 1 М ]ЧаС1, 0,02 М трис-буфер, 10 3 М реактив Клеланда (pH 7,4 при 22 °С), в течение 24 ч при 4 °С. Далее белок выделяли центрифугированием.[ ...]
РНК ВЖМТ легко выделить в нейтральной или слабощелочной среде; при этом выявляются интактные или почти интактные пустые белковые оболочки (процесс зависит от температуры и ионной силы) (см. гл. XIV).[ ...]
В мягких щелочных условиях можно отделить белок от РНК также у других вирусов, но образующийся при этом продукт часто нерастворим при pH около 7,0 или находится ив в мономерном состоянии (например, Х-вирус картофеля [111]; вирус мозаики дикого огурца [1950]).[ ...]
Для выделения РНК большинства вирусов растений, а также для денатурации и осаждения белка достаточно нагревания при 95—100 °С в присутствии соли (>0,1 М) при pH 7,0 в течение пяти или более минут. Температура, необходимая для освобождения РНК какого-то определенного вируса, может сильно зависеть от pH и ионной силы среды.[ ...]
Вернуться к оглавлению