При работе с вновь выделенными вирусами или при попытках выделить их главной задачей является очистка вируса, которая была бы достаточной для того, чтобы идентифицировать инфекционные частицы и по крайней мере предварительно охарактеризовать их. Наиболее удобным в этом случае является метод центрифугирования очищенных препаратов в градиенте плотности сахарозы. После фракционирования можно определить иифек-ционность либо в каждой отдельной фракции, собранной из градиента, либо комбинируя их, если присутствует многокомпонентный вирус. Далее можно снять спектр поглощения в ультрафиолете и исследовать образцы в электронном микроскопе с целью обнаружения характерных частиц. При этом можно пользоваться методом подсчета в капле, который позволяет выявить количественную связь по всему градиенту между инфекционностыо и присутствием во фракциях характерных частиц вируса. Открытие многокомпонентных вирусов, которые описаны в гл. VIII, привело к тому, что оказалось необходимым в первую очередь осторожно интерпретировать результаты, полученные после центрифугирования в градиенте сахарозы (или в других градиентах). Одним из преимуществ экспериментов в градиенте сахарозы является возможность применения относительно небольших количеств вируса. Кроме того, в этом случае можно получить приблизительную оценку коэффициентов седиментации исследуемых веществ. О том, как используется градиент плотности сахарозы для характеристики многокомпонентных вирусов, можно узнать, взглянув на фиг. 39.[ ...]
Применительно к вирусным компонентам или к вирусам, стабильным в концентрированных солевых растворах, равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия является более чувствительным критерием гомогенности, чем скоростное центрифугирование. Например, при скоростном центрифугировании очищенного препарата иеинфекциоп-ного нуклеопротеида В0, выделенного из вируса желтой мозаики турнепса, обнаруживается один компонент (фото 4, А), тогда как при равновесном центрифугировании того же препарата в хлористом цезии удается четко выявить смесь, содержащую более чем один компонент (фото 4, В).[ ...]
Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса. Таким образом, в очищенных препаратах можно •обнаружить белковую фракцию I, фитоферритин или фрагменты мембранных •структур клеток растения-хозяииа. Низкомолекулярные белки и другие низкомолекулярные вещества не обнаруживаются в этом случае, если только они не кристаллизуются на пленке-подложке и не присутствуют в препаратах в относительно больших количествах.[ ...]
Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обладают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувствительных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез (гл. XV).[ ...]
Для вирусов с хорошо установленным элементарным химическим составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаружить примеси, содержащие азот иди фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющий обнаружить всего-навсего одну аминокислоту. Можпо также использовать метод «отпечатков пальцев» для разделения пептидов триптического гидролизата хорошо •охарактеризованных вирусных белков, но чувствительность его как критерия чистоты также невысока.[ ...]
Вернуться к оглавлению