При анализе белков из вегетативных органов растений происходит быстрое окисление тиразиновых остатков полифенолоксидазами, попадающими в экстракт при измельчении тканей. Внешнее проявление ферментативного окисления полифенолов фиксируется по побурению экстракта. Побурение в экстракте устраняют введением в экстрагирующий раствор «защитных добавок» с восстановительными свойствами -аскорбиновую кислоту, ЭДТА и др.[ ...]
Экстракцию белков проводят при помощи системы буферных растворов, которые не нарушают структуры белковых молекул. В основу экстрагентов положен трис-глициновый буферный раствор pH 8,3.[ ...]
Навеску свежего растительного материала массой 2 - 3 г растирают в фарфоровой ступке на холоду при Г = 2-4°С с небольшим количеством промытого кварцевого песка, добавляя туда постепенно трис-буфер для равномерного растирания, первоначально 3-4 см а затем добавляя по 1 см3 (время растирания не должно превышать 10 мин).[ ...]
Гомогенную массу количественно переносят в центрифужную пробирку, обмывают ступку и пестик раствором буфера. Буфер берут в количестве 20 - 25 см"1 на одну экстракцию, гомогенат помещают в холодильник на 1 ч, для экстракции легко растворимых белков, периодически перемешивая содержимое стеклянной палочкой. Затем гомогенат центрифугируют при 15 тыс. оборотов в мин, при ? = 3-4°С в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерные колбы на 100 см".[ ...]
Для качественного анализа белков достаточно однократного извлечения их на холоде в течение указанного времени.[ ...]
Для количественного определения белков экстракцию необходимо повторить еще не менее трех раз, используя то же соотношение навески и раствора и тот же режим центрифугирования. Экстракция считается законченной, если в последнем растворе белок по Лоури не обнаруживается.[ ...]
Надосадочную жидкость последующих экстракций сливают в ту же мерную колбу, буфером доводят объем до метки. Раствор используют для количественного определения белка по Лоури, а также для электрофореза в полиакриламидном геле.[ ...]
Для экстракции труднорастворимых белков осадок в центрифужной пробирке заливают буферным раствором С из расчета 6 см" на 1 г навески материала, перемешивают и извлекают на холоду (2-4°С) в течение часа. Суспензию центрифугируют при охлаждении 3-4°С, в течение 15 мин при 15 тыс. об./мин.[ ...]
Раствор Б применяется для извлечения легкорастворимых белков из растений, содержит антиокислительные добавки, pH 8,3. 5 г аскорбиновой кислоты; 1,2 г едкого натра: 1 г трилона Б (двунатриевая соль этилендиамин тетрауксусной кислоты); 0.5 г диэтилдитиокарбомата натрия растворяют в растворе А и доводят общий объем до 1 дм3.[ ...]
Вернуться к оглавлению