При использовании денситометрического метода интенсивность окраски вещества в зоне измеряется непосредственно на хроматограмме. Рассмотрим две серии параметров, влияющих на точность и воспроизводимость результатов.[ ...]
Параметры, связанные с эксплуатацией прибора. Определение основано на том, что окрашенное пятно сканируется с помощью луча света и некоторая часть лучистой энергии поглощается, причем количество поглощенной энергии обусловлено интенсивностью окраски. Последняя оценивается по разности, т. е. путем возвращения непоглощенного света на фотоумножитель, который измеряет интенсивность падающего пучка света, или на второй фотоумножитель, находящийся в балансе с первым. Разность интенсивности падающего и отраженного или проходящего света регистрируется кривой на диаграмме или интегратором. При этом существует определенное соотношение между площадью пика, показаниями интегратора и количеством вещества в пятне.[ ...]
Оптическая система прибора сконструирована так, что если существует равновесие между контрольным пучком света и светом, отраженным от адсорбента, то перо самописца проводит непрерывную прямую линию и интегратор не считает. Если свет поглощается окрашенным пятном, то перо описывает кривую, пик которой соответствует максимуму поглощения. В то же время интегратор считает, причем скорость счета увеличивается по мере удаления пера от линии уровня фона.[ ...]
Если граница окрашенного пятна четко выражена и цвет адсорбента между смежными пятнами белый, перо возвращается к линии уровня фона и интегратор перестает считать.[ ...]
Площадь пика при этом должна быть связана линейной зависимостью с показателем интегратора.[ ...]
Применяются два метода сканирования пятен: в отраженном и в проходящем свете. В отношении выбора того или иного метода нельзя дать никаких рекомендаций, вопрос решается экспериментально.[ ...]
Поведение светового пучка при его падении на поглощающий материал очень сложно. Некоторую информацию по этому вопросу можно найти в работе [65], котя описанное в ней спектрофотометрическое определение веществ в биологических тканях нельзя строго сравнивать с поглощением света окрашенными веществами, адсорбированными на тонких слоях адсорбента.[ ...]
При методе пропускания поглощается больше лучей, чем при методе отраже; ния, так как пучок света, проходя через сплошной слой, контактирует с более окрашенным веществом, чем в случае отражения от поверхности. При методе пропускания будет рассеиваться большее количество лучей, поэтому с целью уменьшения этого рассеивания адсорбент пытаются превратить в непрозрачный материал, обрабатывая его жидким парафином. Все же количество рассеянного , света при сканировании неизвестно и зависит от факторов, не связанных с конструкцией прибора.[ ...]
Направление сканирования возможно по двум степеням свободы: вдоль направления развития хроматограммы на пластинке или перпендикулярно к нему. Второй метод выбирают только в том случае, когда пятна не полностью разделены и когда между разделенными пятнами располагаются примеси, не дающие возможности вернуться к линии уровня фона. Однако следует указывать, в каком направлении должно быть выполнено сканирование, в горизонтальном или вертикальном, с целью обеспечения прохождения света по всей площади пятна или через его центр. Скорость сканирования для всех наблюдений должна быть постоянна.[ ...]
Параметры, связанные с обработкой хроматограммы. При денситометриче-ском определении желательно, чтобы адсорбент оставался белым или его окраска отличалась от цвета окрашенного вещества таким образом, чтобы при использовании подходящих фильтров он мог рассматриваться как белая подложка. Окрашенное пятно должно иметь отчетливые, хорошо очерченные границы. Окраска должна быть устойчивой к действию света в течение продолжительного времени, а ее интенсивность — максимальной и воспроизводимой для данной концентрации вещё-ства. Для количественных целей должно существовать определенное соотношение между интенсивностью окраски и количеством присутствующего вещества.[ ...]
Вернуться к оглавлению