В колбу № 2 добавляют 10 мл концентрированной среды, указанного выше состава и 10 мл обычного мясо-пептонного бульона.[ ...]
Одновременно с этим в колбу № 3 вносят 90 :мл обычного мясо-пептонного бульона и 10 мл индикаторного фага в рабочем разведении.[ ...]
Фаг в рабочем разведении должен содержать десятки тысяч корпускул в 1 мл поэтому при титре фага равном, например, 3—5х 10® в 1 мл разводят его последовательно в 10 000 раз, а при титре фага равном 2—3 х 10 в 1 мл —, в 100 000 раз.[ ...]
Рабочее разведение фага готовится следующим образом: тщательно соблюдая правила стерильности, вскрывают ампулу цельного фага (титр — 5 X Ю8) и переносят 1 мл его во флакон, содержащий 100 мл МПБ, и тщательно перемешивают. После разведения в 100 раз титр фага снизится до 5-х 106. Так как для постановки РНФ используется рабочее разведение 5 х Ю4, полученный фаг необходимо развести еще в сто раз. Для этого в пробирку, содержащую мясо-пептонный бульон в количестве 9,9 мл, вносят 0,1 мл индикаторного фага из предыдущего разведения. Это второе разведение и используется в опыте как рабочее. В порядке постановки опыта титр индикаторного фага снижается до десятков корпускул в 1 мл, что дает возможность учесть результат исследо-дования.[ ...]
Все три колбы помещают в термостат при 37°С на 4х/2 —5 часов. Для увеличения чувствительности реакции время ..инкубации опытной колбы увеличивается до 16—18 часов.[ ...]
После инкубации в термостате из содержимого каждой колбы дополнительно делают разведения обычным мясо-пептонным бульоном. Разбавление должно быть таким, чтобы при высеве 1 мл из колбы № 3 (контроль титра фага) на чашках появлялось несколько десятков негативных колоний фага (стерильные пятна). В этой колбе, как отмечено выше, индикаторный фаг с учетом предварительного его разведения содержит в 1 мл несколько тысяч корпускул. Чтобы получить в конечном разведении несколько десятков корпус-» кул фага в 1 мл, необходимо содержимое этой колбы развести еще в 100 раз (т. е. внести микропипеткой 0,1 мл содержимого в 9,9 мл бульона). Аналогичные разведения делают с содержимым остальных.[ ...]
Микрофлора, содержащаяся в смесях, должна быть инактиро-рована. С этой целью содержимое каждой пробирки прогревается в водяной бане при 56—58° в течение 30 минут. После инактивации содержимое этих пробирок используется для определения числа корпускул фага методом агаровых слоев.[ ...]
Метод агаровых слоев. При исследовании методом агаровых слоев необходимо заранее заготовить 1,5 и 0,7% мясо-пептонный агар. Для подавления воздушной микрофлоры перед разливкой к 1,5% МПА добавляют 0,04% спиртовый раствор генцианвиолета (0,1 мл на 100 мл среды) и разливают ее в чашки по 25—30 мл.[ ...]
Чашки подсушивают в термостате 2—3 часа (агар можно разливать накануне дня исследования).[ ...]
Вернуться к оглавлению